From 2007.igem.org

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Our Aim

大腸菌同士を吸着させるため，我々は（細胞の外側に突出しているもののうち）鞭毛に着目した． （図：イメージ）

About flagella

大腸菌は5~10?本/細胞（＜chemotaxisの本で要確認）の鞭毛を持つ．鞭毛を回転/逆回転させることにより環境の良い場所へとtaxisする．鞭毛は長さ約10~15μm，半径約23nmの空孔のチューブ状である．（図：菌全体）

鞭毛のフィラメント部はFliCという蛋白質が規則正しく配列した多量体である．（図：鞭毛アップ）

FliCはD0,D1,D2,D3ドメインを持つ．(種類によってはD1,D2,D3の３つのドメインを持つ)D1とD2はformation of the functional flagellar formation(ffff)の為に必要であるが，D3ドメインは必要でなく可変である（図：蛋白質構造＆鞭毛断面図）

(Ref)

"Variable" FliC D3 domain

可変なD3ドメインに他の＜__aaまでの＞アミノ酸を挿入しても鞭毛が合成される[2]. 詳細も書く．

References

1. Kuwajima, G. et al.: Nature Biotechnology, 6, 1080-1083 (1988).
2. Tanskanen, J. et. al.: Appl. and Env. Microbiol., 4152-4156 (2000)

Parts Assembly

FliC-hisの作成

• FliC遺伝子のD3領域に、Histidineループをコードする遺伝子を挿入し、ヒスチジンタグとして発現させる。

→Linker Ligation

• 完成プラスミド

• Phenotypeをチェック→SDS-PAGE,Western-Blotting
• ヒスチジンタグがFliC遺伝子の外側に発現していることを確認する。

→Beads adsorption

FliC-His generator

• His-tagを入れたFliCをpLuxの下に置き、LuxRが発現されている条件のもとならば、Quorum SensingでFliCを発現させることができるようにする。
• Quorum Sensingのための遺伝子回路がcolEI oriのvectorに乗っているために、p15Aのベクターを使いdouble transformation することでQuorum Sensingと合わせることができるようになる。
• pLuxをもつベクター側とFliCをPCRを使って、Ligationさせることで作る。

FliC-his biobrick

必要なこと

• puc19 vectorの乗っているのでbiobrickのベクターに乗せる。
• 制限酵素サイト(EcoRI,SpeI,PstI)をつぶす。

• FliC His-TagにはEcoRI,SpeI,PstIが含まれているために、そのままではvectorに入れられない。

#片側をblunt end もう一方をApaIの制限酵素サイトをつけ、PCRする。
#vector側も同様にPCRしLigationさせる。

Experiments

Phenotype Check: SDS-PAGE,Western-Blotting

• SDS-PAGE,Western-Blotting

約70kDaにバンドが出ている→FliCが発現していることが確認された

SDS-PAGEを転写。70kDaに抗体抗原反応による茶色いバンドが出た→Histidineの発現が確認された。

Display Check1: Swarming test

Display Check2: Beads Adsorption

• pUC19-FliC-His(Keio⊿FliC株),no-plasmid(Keio⊿FliC株)

Co2+,Ni2+有り・無しでビーズ吸着→吸着しない

• pUC19-FliC-His(Keio⊿FliC株・⊿motB),no-plasmid(Keio⊿FliC株・⊿motB)

co2+,Ni2+有り無しでビーズ吸着→吸着した

• Beads adsorption Protocol