Chiba/Flagella/Making FliC-his
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| - | #pUC19 vectorにFliCをコードする遺伝子を挿入→pUC19-FliC | + | #pUC19 vectorにFliCをコードする遺伝子を挿入→pUC19-FliC |
| - | # | + | #ExSite PCR |
#design insert(ヒスチジンタグ) | #design insert(ヒスチジンタグ) | ||
#pUC19-FliC vector とinsertオリゴをライゲーション. | #pUC19-FliC vector とinsertオリゴをライゲーション. | ||
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| - | * | + | *ExSite PCR |
**design primer | **design primer | ||
FliCの可変領域のうち、フィラメントの外側部分から５か所を選び、プライマーを設計(207,228,240,252,267) | FliCの可変領域のうち、フィラメントの外側部分から５か所を選び、プライマーを設計(207,228,240,252,267) | ||
pUC19-FliCをpUC19-FliC-vectorに | pUC19-FliCをpUC19-FliC-vectorに | ||
***[PCR表] | ***[PCR表] | ||
| - | ***[ | + | ***[Reaction Conditions] |
**Template 1μL | **Template 1μL | ||
| - | **Primer( | + | **Primer(Foward and Reverse) 5μL |
**10×buffer 10μL | **10×buffer 10μL | ||
**dNTPmix 10μL | **dNTPmix 10μL | ||
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| - | *pUC19-FliC vector とinsertオリゴをライゲーション. | + | *Ligation pUC19-FliC vector とinsertオリゴをライゲーション. |
| - | ***[ | + | ***[Reaction Conditions] |
**insertオリゴ 2μL | **insertオリゴ 2μL | ||
**pUC19-FliC vector 2μL | **pUC19-FliC vector 2μL | ||
Revision as of 04:37, 27 October 2007
- pUC19 vectorにFliCをコードする遺伝子を挿入→pUC19-FliC
- ExSite PCR
- design insert(ヒスチジンタグ)
- pUC19-FliC vector とinsertオリゴをライゲーション.
- GelCheck
- ExSite PCR
- design primer
FliCの可変領域のうち、フィラメントの外側部分から５か所を選び、プライマーを設計(207,228,240,252,267) pUC19-FliCをpUC19-FliC-vectorに
- [PCR表]
- [Reaction Conditions]
- Template 1μL
- Primer(Foward and Reverse) 5μL
- 10×buffer 10μL
- dNTPmix 10μL
- vent 1μL
- dH2O 68μL
- design insert
- six histidine loop peptide ("His-loop")
- アミノ酸配列-Ser-Ser-His-His-His-His-His-His-Ser-Ser
- encoded by the oligo 5'-TCT-TCT-CAT-CAT-CAT-CAT-CAT-CAT-TCC-TCC-3'
- and anti oligo 5'-GGA-GGA-ATG-ATG-ATG-ATG-ATG-ATG-AGA-AGA-3'
- 制限酵素サイトN末端EcoRⅠ,C末端NcoⅠ
- Ligation pUC19-FliC vector とinsertオリゴをライゲーション.
- [Reaction Conditions]
- insertオリゴ 2μL
- pUC19-FliC vector 2μL
- ×5 Ligase Buffer 4μL
- Ligase 1μL
- dH2O 11μL
- GelCheck(3973bp)
