Octubre: Segunda Semana

Se hicieron digestiones con diferentes encimas usando varios procedimientos estandarizados seguidos por ligaciones. Este fue la primera vez montando todas las partes diferentes.

Se llevaron a cabo varios experimentos para probar las nuevas secuencias y partes e insertarlas en las células para la transformación. Celulas transformadas y sin transformar con diferentes concentraciones de hierro fueron expuestas a diferentes condiciones ambientales.

Esta semana tuvimos varias situaciones que dificultaron el trabajo en el laboratorio. Por ejemplo:

1. Tuvimos que ajustar las concentraciones de antibiótico varias veces hasta encontrar la concentración correcta. Para esto utilizamos diferentes concentraciones de ampicilina para los plasmados hasta llegar a la que era. Encontramos que la concentración necesaria de ampicilina era entre 50ug/mL y 100ug/mL. Decidimos usar 100ug/mL para evitar falsos positivos. Sin embargo, en el momento no teníamos stock de Xgal, lo cual era necesario para hacer una prueba altamente efectiva a concentraciones menores de ampicilina. Como solución, preparamos el LB sólido en cajas con 100ug/mL de ampicilina y las usamos para crecer las células que habían sido transformadas la noche anterior (mantenidas a 4 grados Celsius).

2. Los tiempos de transformación no han sido los más óptimos, normalmente el tipo se cuenta empezando con la primera secuencia transformada (que en nuestro caso fue positiva), y después se estima el tiempo. Como se nos acabaron las células competentes, fue necesario hacer mas para el stock.

3. Aunque hicimos el intento de utilizar células competentes comerciales importadas de los EE.UU. no se pudieron utilizar a que llegaron una semana después de haber sido enviadas y ya habían perdido su viabilidad. Por ende, dependíamos de las células que ya habíamos hecho; esto requirió de mucho tiempo trabajando en el laboratorio.

4. Los procesos de transformación, corte y ligación se hicieron paralelamente. Las primeras ligaciones fueron hechas utilizando XbaI y SpeI, luego, los extremos 5’ del ADN plasmidico fueron desfosforilados (para que el ADN no se recircularizara). En este proceso encontramos que teníamos que hacer una precipitación y separación del ADN por extracción con cloroformo y precipitación con alcohol. Como no teníamos fenol saturado, paramos la reacción con un CIAP stop buffer e inmediatamente le dimos un choque térmico a las secuencias de AND para evitar dicha recircularizacion. El método funciono. Después, se purifico la muestra de enzimas y buffer de la fosfatasa CIAP usando un kit de purificación de PROMEGA (cat. #A9281). Los resultados se encuentran en el Informe de Electroforesis.

5. Ya tuvimos un problema en el que se nos acabaron las células para transformar los plasmados y partes utilizadas. Para resolver la situación, dividimos cada tubo con células en 4 tubos y para la sorpresa de todos, el método ha funcionado, con un menor rendimiento, pero ha dado.