Freiburg07/labnotes

From 2007.igem.org

Revision as of 16:19, 12 August 2007

Fri, 3rd August 2007

workers: Natalia, Moritz
assessment of the 9 colony o/n cultures with 2,4,6 aa linker calmodulin

Sat, 4th August 2007

Philipp (12-14Uhr):
-Evaluation of the overnight-background-tests with the beta-lactamase/calmodulin-constructs in e.coli
-Centrifugation and labeling of the o/n cultures (of e.coli) containing various iGEM-parts

Mon, 6th August 2007

11 bis 14 Uhr
Anwesend: Corinna, Dario, Kristian, Moritz, Natalia, Philipp
Besprechung der Ergebnisse der letzten Woche
Schnittstellenplanung für spezifische iGEM-Schnittstellen:
- ca. 20% geschafft
blac1-calmodulin-blac2:
- Test für Hintergrund bis zu Amplcilin-Konzentrationen von 200 µl/ml; alle positiv! PCB-Planung:
- Anfragen für feritges Plasmind per E-Mail; Warten auf Antwort
- Planung für Klonierung aus iGEM-Kit steht, falls wir das Plasmid selbst zusammenbasteln müssen
dhfr1-winzip-dhfr2a:
- Die letzte Sequenzierung zeigte Felher im Konstrukt. Für eine neue Sequenzierung wurden eine anderer Klon gepicked. Die DNA für die nächste Sequenzierung wurde bereits geprept.
Planung Fhy1 und PhyA:
- mögliche Kombinationen wären: dhfr1-Fhy1; PhyA-dhfr2; blac1- Fhy1; PhyA-blac2; Kombinationen mit YFP/CFP werden vielleicht von Urs zusammenkloniert

Planung der Arbeit für die laufende Woche ( 6.8. bis 10.8.2007 )
1. Testverdau und Sequenzierung des Plasmids pFR320dp-blac1-winzip-blac2 (Philipp)
2. Testverdau und Sequenzierung des Plasmids pFR320dp-blac1-calm-blac2 mit 3 verschiedenen Linkerlängen (Natalia, Dario)
3. Primer von PhyA und Fhy1 für PCR planen (Moritz)
4. PCB-Enzyme aus iGEM-Kit zusammenklonieren (Moritz)
5. Reinigung der Konstrukte:
Ansetzten der Übernachtkultur und einer Expressionskultur (Corinna)
Messung der OD und Zellernte (Philipp, Dario)
Dialyse (Philipp, Max)
6. Digitalisierung der Laborjournals (Corinna, Natalia)
7. Hintergrundtest für ein Konstrukt - 4GlyLinker- wiederholen (auf Platten) bei Konzentrationen von 50, 100, 200 und 400 µg/ml Ampicilin (Max)
8. Testverdau und Sequenzierung des Plasmids blac1-winzip-dhfr2 (Dario, Natalia)

Zeitplan der laufenden Woche
Moritz: 9 bis 14 Uhr
Dario: 9 bis 17 Uhr(Mo, Mi, Fr)
Philipp: 17 bis 18 Uhr
Corinna: 18 bis 19 Uhr
Natalia: 9 bis 14 Uhr
Max: ???

Philipp:
Planung und Ansatz des erneuten Testverdaus von dFR320dp-blac1-winzip-blac2, diesmal mit BssSI
Corinna
19.00 Uhr: Verdau-Ansatz von pFR320dp-blac1-winzip-blac2 aus 37 °C-Raum gegholt und Testgel bei 100 V laufen gelassen
20.15 Uhr: Photo von Gel aufgenommen; Auswertung: nur 1 Bande zwischen 2500 und 3000 bp zu erkennen; die eigentlich erwarteten kleineren Banden sind weder auf dem Photo noch im Gel zu erkennen. Evtl. war die eingesetzte DNA-Kontentration zu gering, die große Bande war auch nur relativ schwach zu sehen. 21.00 Uhr: Protokoll des Treffens digitalisiert

Di, 7th August 2007

10 bis 15 Uhr
Moritz: Planung der Klonierung von iGEM Parts für PCB Synthese.
Verdau von folgenden iGEM Parts:
B0034 mit SpeI und PstI (Vektor)
I15008 mit XbaI und PstI (Insert1)
I15009 mit XbaI und PstI (Insert2)
Verdau ab 14 Uhr im 37 Grad Raum!

10 bis 15 Uhr
Natalia:
Plasmidkarten erstellt:
1. pFR320p_b1_2calmo2_b2
2. pFR320p_b1_4calmo4_b2
3. pFR320p_b1_6calmo6_b2
alle Plasmidkarten sind im neuen Ordner bla_calm_bla
Testverdau geplant.

18.30 Uhr
Corinna:
Verdau aus 37 °C-Raum geholt und eingeforen bei -20 °C

Mi, 8th August 2007

Moritz (9 - 15.30 Uhr):
- Planung PhyA und FHY1 PCR
- Prep. Gel für Verdau von iGEM Parts: Vektor und Insert1 bzw. Insert2 ausgeschnitten
- Gelextraktion von Vektor, Insert1 und Insert2
- Konzentrationsbestimmung der geprepten DNA
- Ligation (2Ansätze): Vektor(pSB1A2/B0034) + Insert1(I15008) bzw. Insert2(I15009)

Max (12 - 16.20 Uhr):
- Amplifikation von b1-calmo-b2 Glycerin-stock Zellen
- Vorbereiten von Agar-Platten mit unterschiedlichen AMP Konzentrationenbr( Hintergrundtest)
- Ausstreichen der amplifizierten b1-calmo-b2 zellen auf je 3 Amp-Platten (37°C Raum über Nacht)

Dario (14-18):
- Planung und Ansetzen von Testverdau für Plasmid dFR320_b1_winzip_dhfr2a
- Gellauf des Testverdaus von Plasmid pFR320_b1_#calmo#_b2
- Auswertung des Testgels

Corinna (15-16 Uhr):
- Ansatz einer über-Nacht-Kultur von Zellen mit pFR320dp-blac1-clamo-blac2 (Linkerlänge 4AS) bei 28 °C

Do, 9th August 2007

Gruppenbespechung (12 - 14 Uhr)
Anwesend: Natalia, Corinna, Dario, Moritz, Max, Philipp

Allgemeine Sachen:
- Eppis besser beschriften (Datum, Plasmid/Zellen, wurde Testverdau/Sequenzierung gemacht, bei Fragmenten Enzyme angeben
- Liste von Inhalt der Boxen erstellen (Dario)
- Anlegen einer neue Box nur für Plasmide

Ergebnisse seit dem letzten Treffen und weitere Planung:

1. Testverdau und Sequenzierung pFR320dp-blac1-winzip-blac2:
- unklares Ergebnis; Testverdau wiederholen: aus Glycerinstock eine Über-Nacht-Kultur ansetzten - Miniprep - Verdau (Philipp, Natalia)
2. Testverdau und Sequenzierung pFR320dp-blac1-calmo-blac2:
- unklares Ergebnis; Testverdau mit mehr DNA und mehr Enzym wiederholen, Gel nicht zu lange laufen lassen
3. Primer für PhyA und Fhy1: läuft (Moritz)
4. PCB: läuft (Moritz)
5. Reinigung des Konstrukts blac1-4-calmo-4-blac2: - kaum Wachstum in der Über-Nacht-Kultur; angeimpfte Expressionskultur wächst ebenfalls sehr langsam
mögliche Erklärungen: falsches Plasmid, falsche CAM-Konzentration, Temperaturabhängigkeit (28 °C!) der Plasmidkopien, XL-1 blue, toxisches Produkt; Zellen wachsen anscheinend sehr langsam
Sonntag: von allen 3 Konstrukten Über-Nacht-Kulturen von Klon 1 ansetzen (Corinna)
6. Digitalisierung: läuft (Natalia, Corinna)
7. Hintergrund-Test (AMP):
- Wachstum bei allen Konstrukten und allen getesteten Konzentrationen, konstitutive Aktivität?
8. Testverdau und Sequenzierung pFR320dp-blac1-winzip-dhfr2: Gel wird gerade ausgewertet (Dario)

neues Projekt:
- kleines Lactamase-Fragment aus dem Plasmid entfernen (Umklonierung)

Moritz (9.30 - 15 Uhr):
- Transformation der Ligation in RV 308 (chem. kompetent):
es wurde die Ligationen Vektor + Insert1 (pSB1A2/B0034 + I15008),
sowie Vektor + Insert2 (pSB1A2/B0034 + I15009) transformiert.
- Besprechung mit Kristian wegen Primern für FHY1 und PhyA:
es besteht noch weiterer Planungsbedarf da die Primer kompliziert aufgebaut sind :-P !!!!

Corinna (8.00 - 9.30 Uhr):
- In der über-Nacht-Kultur war in einem Ansatz nur eine sehr geringe Trübung als Zeichen für Wachstum zu erkennen, im anderen Ansatz war das Medium sogar noch klar.
- Trotzdem: Ansatz der Expressionskultur für die anschleißende Reinigung des Konstrukts blac1-4calmo4-blac2

Dario (8.30 - 16 Uhr):
- Gel laufen lassen von Testverdau für Plasmid dFR320_b1_winzip_dhfr2a mit KpnI und AflIII, Auswertung zeigte
die von uns geplannte Banden
- Gellauf des Testverdaus von Plasmid pFR320_b1_#calmo#_b2 ausgewertet und die von uns geplanten Banden
waren nicht zu erkennen, mögliche Fehlern: Gel zu lang laufen lassen oder Volumen an Plasmid
- Wiederholung von Testverdaus von Plasmid pFR320_b1_#calmo#_b2 mit SpeI und KpnI. Noch nicht ausgewertet
- Messung von Optische Dichte (OD) von Expressionskultur pFR320p_blac1_4calmo4_blac2 (von Corinna):
OD Werte waren sehr niedrig und ist gar nicht gewachsen. Muss wiederholt werden. Wird wahrscheinlich
mit pFR320p_blac1_2calmo2_blac2 wiederholt

Max (12 - 16Uhr):
- Auszählen der verschieden konzentrierten AMP platten mit b1-calmo-b2 konstrukten ergab, dass alle platten
übertrieben bewachsen wahren und keine Aussage über die Funktionalität der unterschiedlichen Konstrukte
getroffen werden konnte. Grund dafür ist wohl fehlerhaftes Ampicilin , dass für die Platten verwendet wurde!
- Ansetzen von 20 1ml Aliquots Ampicilin (100 mg/ml) für neue platten und verdünnungstestreihe der konstrukte

Philipp (12-16Uhr):
- Ansatz der ÜNK von Klon B1 (Glycerinstock) zur Auffrischung des Bestandes an pFR320dp-blac1-winzip-blac2
-Verschiedene kleinere Arbeiten (Etikettieren, Boxen, Auswertung...)

Fr, 10th August 2007

Moritz (9 - 14 Uhr):
- Ansetzen einer Übernachtkultur von Trafo - Platten:
Die Platten waren dich bewachsen! Es könnte sich um Platten mit fragwürdigem Amp handeln (leider habe ich es zu spät gemerkt) und dadurch könnten die Colis (RV 308) das Plasmid verloren haben!! Die Vermutung liegt nahe, da in der ÜNK noch keine Zeichen von Wachstum zu erkennen sind (nach 3,5 Stunden).
- Planung der Primer (PhyA u. FHY1) fast abgeschlossen (werden noch mit gcg ausgewertet und Kristian muss noch sein OK geben).

Max (13.30 - 16.30 ):
- Aufzucht von b1-calmo-b2 zellen mit 2,4 und 6 Glycinen linker aus den Glycerin stocks für 1 Stunde
- Giessen neuer Platten mit je 25µg CM und 50µg, 100µg, 200µg sowie 400µg Amp, für eine neue Verdünnungs-testreihe
- Ausplattieren der angereicherten b1-calmo-b2 Zellen auf den Platten; Bebrütung bei 37°C über Nacht

Corinna (15.00 - 17.00 Uhr):
- Kulturen (von Moritz) aus 37 °C-Raum geholt. In allen 6 RGs sind die Zellen gewachsen.
- Anlegen von Glycerin-Stocks - Miniprep von allen Proben

Sa, 11th August 2007

Max (12.30 - 14.00 uhr):
- Auszählen der Platten mit den unterschiedlichen Amp Konzentrationen; Dabei war ein Trend der Zellen mit 2- und 6 Glycinen Linker zu erkennen, bei höheren Amp konzentrationen schlechter zu wachsen! Die Zellen mit 4 Glycinen als Linker zeigten überhaupt kein wachstum auf 50, 200 und 400 µg Amp wobei auf 100 µg nur 4 veeinzelte klone zu sehen waren. Mit Klon 1 b1- 4calmo4 -b2 sollte eine weitere Verdünnungsreihe unter Zugabe verschiedener Calciumtiter durchgeführt werden!

So, 12th August 2007

Corinna: (13.00 -14.15 Uhr)
- Ansatz von Ü/N-Kulturen aus Glycerinstocks von Zellen mit allen 3 Linkerlängen (immer Klon 1 verwendet)bei 28 °C; es soll das Wachstum beobachtet werden, da bei der letzten Ü/N-Kultur (Linkerlänge 4 AS)nach über 16 h kaum Zellen gewachsen sind.