Chiba/Engeneering Flagella

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(Display Check: Beads Adsorption)
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*pUC19-FliC-His(Keio⊿FliC株),no-plasmid(Keio⊿FliC株)
*pUC19-FliC-His(Keio⊿FliC株),no-plasmid(Keio⊿FliC株)
Co2+,Ni2+有り・無しでビーズ吸着
Co2+,Ni2+有り・無しでビーズ吸着
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→吸着しない
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*pUC19-FliC-His(Keio⊿FliC株・'''⊿motB'''),no-plasmid(Keio⊿FliC株・'''⊿motB''')
*pUC19-FliC-His(Keio⊿FliC株・'''⊿motB'''),no-plasmid(Keio⊿FliC株・'''⊿motB''')
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→吸着
→吸着

Revision as of 08:00, 23 October 2007

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大腸菌同士を吸着させるため,我々は(細胞の外側に突出しているもののうち)鞭毛に着目した. (図:イメージ)

About flagella(鞭毛についての説明)

大腸菌は5~10?本/細胞(<chemotaxisの本で要確認)の鞭毛を持つ.鞭毛を回転/逆回転させることにより環境の良い場所へとtaxisする.鞭毛は長さ約10~15μm,半径約23nmの空孔のチューブ状である.(図:菌全体)

鞭毛のフィラメント部はFliCという蛋白質が規則正しく配列した多量体である.(図:鞭毛アップ)

FliCはD0,D1,D2,D3ドメインを持つ.(種類によってはD1,D2,D3の3つのドメインを持つ)D1とD2はformation of the functional flagellar formation(ffff)の為に必要であるが,D3ドメインは必要でなく可変である(図:蛋白質構造&鞭毛断面図)

(Ref)


"variable" FliC D3 domain

可変なD3ドメインに他の<__aaまでの>アミノ酸を挿入しても鞭毛が合成される[2]. 詳細も書く.

References

  1. Kuwajima, G. et al.: Nature Biotechnology, 6, 1080-1083 (1988).
  2. Tanskanen, J. et. al.: Appl. and Env. Microbiol., 4152-4156 (2000)

Our Projet: insert his-tag into the flagellin

FliC-hisの作成

  • pUC19 vectorにFliCをコードする遺伝子を挿入→pUC19-FliC
  • FliCの可変領域のうち、フィラメントの外側部分から5か所を選び、プライマーを設計(207,228,240,252,267)し、エキサイトPCR→pUC19-FliC vector
  • EcoRⅠSite,2×Ser,6×His,2×Ser,NcoⅠ siteをコードするオリゴをデザイン。

(six histidine loop peptide ("His-loop")(containing imidazole side chain), -Ser-Ser-His-His-His-His-His-His-Ser-Ser,encoded by the oligo 5'-TCT-TCT-CAT-CAT-CAT-CAT-CAT-CAT-TCC-TCC-3' and anti oligo 5'-GGA-GGA-ATG-ATG-ATG-ATG-ATG-ATG-AGA-AGA-3')

  • pUC19-FliC vector と6×Hisオリゴをライゲーション.

Experiments

Phenotype Check: SDS-PAGE,Western-Blotting

Display Check: Swarming test

Display Check: Beads Adsorption

  • pUC19-FliC-His(Keio⊿FliC株),no-plasmid(Keio⊿FliC株)

Co2+,Ni2+有り・無しでビーズ吸着


→吸着しない

  • pUC19-FliC-His(Keio⊿FliC株・⊿motB),no-plasmid(Keio⊿FliC株・⊿motB)


→吸着