Chiba/Goal

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Marimo をつくる

鞭毛間吸着テスト
有限確認テスト
りんご飴アッセイ

鞭毛間吸着test

senderとreceiver同士がHis-Tagで吸着しているかを確認するためのテストである。このテストでは、His-tag同士の吸着を阻害するimidazolを用いて行う。

1.Senderとreceiverをそれぞれ培養し、receiverの培養液の中に、senderを１滴加える。
2.その中に金属イオンを加えると、senderとreceiverが鞭毛同士で吸着し始める。
3.ある程度吸着したら、imidazolを加えたものとそうでないものをプレートにまく。
4.imidazolを加えたものはばらばらのコロニーができ、imidazolなしのものは、senderとreceiverが
  くっついているので、くっついたコロニーができる。

有限確認test

マリモを作る前の段階として、マリモの成長が有限の大きさで止まるか２次元で確認するためのテストである。

1.senderとreceiverを試験管でそれぞれ培養する。
2.receiverをプレートに均一にまき、senderを真ん中に少量スポットし一晩培養する。
3.senderの近く（GFPを発現している)、中間、遠く（GFPを発現していない）から数箇所ずつ菌をとってそれぞれ希釈液を作る。
4.希釈した菌にCo2+を加えてプレートにまく。
5.FliCを発現していなかったreceiverは、ばらばらのコロニーを作り、FliCを発現していたreceiverは塊になったコロニーを作る。

りんご飴アッセイ

ついに毬藻を作る！！！

AHLはとても小さな分子で、自由度が高いので、拡散するのが早い。

キャピラリーを利用することによって、senderが生産するAHLの拡散を遅くし、AHLの濃度勾配を作ることができる。濃度勾配によってより球体に近いマリモができる。

1.receiverとsenderを一晩培養する。Receiverの培養液の中にはコバルトイオンをまぜておく。
2.キャピラリーでsenderを吸い取り、receiverの培養液の中に加える。
3.Senderの出したAHLが拡散し始める。
4.ReceiverはAHLを感じてGFPを発現する。また鞭毛を生やし、Ni２＋を介してHisタグ同士で吸着し始める。
5.集合が成長してマリモになる。

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