From 2007.igem.org

Revision as of 15:18, 25 October 2007 (view source) Masahiro (Talk | contribs) (→FliC-hisの作成) ← Older edit		Revision as of 15:32, 25 October 2007 (view source) Masahiro (Talk | contribs) (→Purpose) Newer edit →
Line 69:		Line 69:
	====Purpose====		====Purpose====
	FliC-hisが発現され，鞭毛を形成してるか（"鞭毛にFliC-hisがディスプレイされてるか"？）を確認する．		FliC-hisが発現され，鞭毛を形成してるか（"鞭毛にFliC-hisがディスプレイされてるか"？）を確認する．
		+	To confirm that whether flagella is formed.
		+
	====Method====		====Method====
	[[Image:Chiba_fla_beadsintro.png|frame|fig1]]		[[Image:Chiba_fla_beadsintro.png|frame|fig1]]

---

Revision as of 15:32, 25 October 2007

Introduction | Project Design | Engeneering Flagella | Quorum Sensing | Our Goal || Team Members | メンバ連絡簿

Our Aim

大腸菌同士を吸着させるため，我々は（細胞の外側に突出しているもののうち）鞭毛に着目した． In making E.coli sticks together, we focused on their flagella that are located outside of cells.（図：イメージ）

About flagella

大腸菌は5~10?本/細胞（確認しました）の鞭毛を持つ．鞭毛を回転/逆回転させることにより環境の良い場所へとtaxisする．鞭毛は長さ約10~15μm，半径約23nmの空孔のチューブ状である．（図：菌全体）

鞭毛のフィラメント部はFliCという蛋白質が規則正しく配列した多量体である．（図：鞭毛アップ）

FliCはD0,D1,D2,D3ドメインを持つ．(種類によってはD1,D2,D3の３つのドメインを持つ)D1とD2はformation of the functional flagellar formation(ffff)の為に必要であるが，D3ドメインは必要でなく可変である（図：蛋白質構造＆鞭毛断面図）

E.Coli has 5-10 flagella randomly distributed around the cell.Most of the time their flagella rotate in one direction(counterclockwise) and the cell swims in a rather straight line.Intermittently, the flagella rotate in opposite direction or pause, as a result the cell turns or tumbles(depending to the number of flagella that do so)Bacterial flagella consist of three parts:a basal body, a hook, and a filament.The filament of E.Coli is a highly rigid, helical, and cylindrical structure 10-15 μm long,23 nm diameter.It is built from ~20000 subunits of a ~55kDa single protein, flagellin.In the case of E.Coli, there is only one flagellin, FliC.

FliC has three or four domains,D0,D1,D2,D3,and although D1 and D2 are needed for the formation of the functional flagellar filament, D3 does not take part in the formation of flagella. (Ref)

"Variable" FliC D3 domain

可変なD3ドメインに他の＜__aaまでの＞アミノ酸を挿入しても鞭毛が合成される[2]. 詳細も書く．

References

1. Kuwajima, G. et al.: Nature Biotechnology, 6, 1080-1083 (1988).
2. Tanskanen, J. et. al.: Appl. and Env. Microbiol., 4152-4156 (2000)

Parts Assembly

FliC-hisの作成

• FliC遺伝子のD3領域に、Histidineループをコードする遺伝子を挿入し、ヒスチジンタグとして発現させる。

We inserted the gene of six histidine loop peptide (“His-Tag”).

1. Linker Ligation

• 完成プラスミド

• We check the Phenotype

1. SDS-PAGE
2. Western-Blotting

• Display check

1. Beads adsorption

FliC-His generator

• His-tagを入れたFliCをpLuxの下に置き、LuxRが発現されている条件のもとならば、Quorum SensingでFliCを発現させることができるようにする。
• Quorum Sensingのための遺伝子回路がcolEI oriのvectorに乗っているために、p15Aのベクターを使いdouble transformation することでQuorum Sensingと合わせることができるようになる。
• pLuxをもつベクター側とFliCをPCRを使って、Ligationさせることで作る。

FliC-his biobrick

必要なこと

• puc19 vectorの乗っているのでbiobrickのベクターに乗せる。
• 制限酵素サイト(EcoRI,SpeI,PstI)をつぶす。

• FliC His-TagにはEcoRI,SpeI,PstIが含まれているために、そのままではvectorに入れられない。

#片側をblunt end もう一方をApaIの制限酵素サイトをつけ、PCRする。
#vector側も同様にPCRしLigationさせる。

Experiments

Display Check: Beads Adsorption

Purpose

FliC-hisが発現され，鞭毛を形成してるか（"鞭毛にFliC-hisがディスプレイされてるか"？）を確認する． To confirm that whether flagella is formed.

Method

ビーズ吸着の説明． ヒスチジンはCo（またはNi）と錯体結合?をする．表面に金属イオン（本実験ではCo2+およびNi2+）を配置したビーズを使用して，FliC-hisがディスプレイされた大腸菌とそうでないものを調べた．

ビーズには4つのカルボキシル基のついた炭素鎖がついていて、二価の金属イオンの6つの配位部位のうち、4つと配位結合している。さらに残りの二つの配位部位に、Histidineのイミダゾール基が配位する。このため、Histidine Tagが鞭毛にDisplayされている大腸菌と、ビーズ溶液を懸濁させれば、鞭毛上のHistidineと金属イオンとを媒体として、鞭毛がBeadsに吸着する。この懸濁溶液にMagnetを近づけることにより、BeadsはMagnetに引き寄せられ、Beadsを含まない溶液を上澄みとして分離できる。さらにこのBeadsにImidazoleを含むバッファーを加えれば、このImidazoleがHistidineのImidazole基と競合し、金属イオンにHistidineよりも強い力で配位するため、鞭毛がBeadsからはずれる。ここで再びMagnetを近づければ、大腸菌のついていないBeadsと、大腸菌がいる上澄み溶液とに分離される。この上澄み溶液をプレートにinculateし、コロニーをチェックする。コロニーが形成されれば、鞭毛にHistidine TagがDisplayされているということがわかる。

（＜不十分＆不正確です．直してください）

Samples

• GI826(⊿FliC⊿MotB株)
  • pUC19-FliC-His
  • plasmidなし
• GI826(⊿FliC⊿MotB株)
  • pUC19-FliC-his
  • plasmidなし

Procedure

• pUC19-FliC-His,をJW1908(Keio⊿FliC株)にトランスフォーメーション。培養液をビーズと懸濁させ、大腸菌をBeadsに吸着する。

吸着した大腸菌をbufferで溶出し、inculateする。(Negative Control 1:Noplasmid,Negative Control 2:Co2+あるいはNi2+の有り・無し) →吸着していなかった

• pUC19-FliC-His,をGI826(⊿FliC⊿MotB株)にトランスフォーメーション。培養液をビーズと懸濁させ、大腸菌をBeadsに吸着する。

吸着した大腸菌をbufferで溶出し、inculateする。(Negative Control 1:Noplasmid,Negative Control 2:Co2+あるいはNi2+の有り・無し) →吸着していた。

Results

Plasmidあり、かつCo2+つきビーズ、のコロニー数は、その他のものよりはるかに多い。30倍以上。 Histidine Tagの存在によって大腸菌がビーズに吸着吸着していることがわかる。 The number of colony dramatically decreased with out Co2+ or FliC-His plasmid.