Chiba/Quorum Sensing

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==Size Control: Our Aim==
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[[Image:Chiba_proj_ahlconc.png|frame|'''Fig1.'''AHL concentration gradient.]]
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（マリモのサイズをコントロールしたい/しなくてはならない：どっち？）マリモのサイズをコントロールする為にはAHLの届く範囲をコントロールできればよい．
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*AHLの届く範囲をコントロールために以下の３つを考えた：
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*#SenderのAHL生産能力をあげる
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*#ReceiverのAHL感受性をあげる
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*#AHL分解酵素aiiAを使う
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<br clear="all">
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==Our Aim==
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==Improving Sender==
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===Design===
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[[Image:Chiba_ahlsynth.png|frame]]
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AHLはFig.2のpathwayで合成されている．LuxIは十分量発現していると考えられる（の？）ので，中間体（中間物質？名称わかんない）のs-adenosyl methionineの合成を増やしてみる．その為にmetK遺伝子を増やしてみる．
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===Experiment===
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1.Not only express FliC His-tag constant constantly, apply Quorum Sensing as positive feedback genetic switch.
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===Result===
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2.Express aiiA(autoinducer inactivate enzyme A) as an AHL quencher to generate AHL concentration gradient. ?
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3.To make clear the AHL positive feedback, build genetic circuit expressing aiiA negatively on AHL concentration.
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4.Improve the performance of Quorum Sensing.
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1.FliC His-tagをただ発現させるだけではなく、Quorum Sensingをpositive feedbackのスイッチとして利用する。
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2.aiiAをAHL quencherとして利用し、AHLの濃度勾配をつくりだすAsseyにする。
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3.inverterでaiiAのthresholdをはっきり出すような遺伝子回路の設計
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4.Quorum SensingのSensing能力の向上
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フィードバックじゃないのでは...？
 
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==About Quorum Sensing ==
 
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==Improving Receiver==
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===Design===
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[[Image:mut LuxRの感度アップグラフ]]
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mutated LuxRによって感度が上がったという論文があった[ref]．論文によれば1点にmutantをいれた場合〜〜．3点にmutantをいれた場合〜〜．
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私たちは〜〜という理由から，そのうちの１点mutantと２点mutantを作った．
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[[Image:Quorum sensing system.jpg|320x240px]]
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===Experiment===
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[[Image:作ったmut luxr]]
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図のように１点＆２点にミュータントをいれたluxrをsite direct mutagenesisで作成した．
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これを＿＿プラスミドにいれた．
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＿＿により感度を見た．
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====Sender====
+
===Result===
-
AHL Sender express LuxI constantly. LuxI synthesize signaling molecule acyl-homoserine lactone(AHL). AHL go through cell membrane and diffuse into media.
+
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SenderはLuxIを発現する。SenderはAHLを合成する。細胞膜を通り抜け細胞外にAHLは拡散していく。
+
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====Receiver====
+
-
AHL Receiver express LuxR constantly. AHL come through cell membran. AHL and LuxR bind together and activate Lux promoter.
+
-
ReciverはLuxRを発現しLux promoterを含む遺伝子回路を持つ。細胞膜を通り抜けてきたAHLはLuxRと結合して、Lux promoterを活性化する。
+
-
The above genetically circuit
+
==Aiia==（なんかいいタイトルないか）
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上の回路では
+
===Design1===
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1.The sender express luxI and synthesize AHL.
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[[Image:Plux aiiA.jpg|402x45px]]<br>
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2.AHL go through cell membrane and ingest into receiver.
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図のように，AHLのシグナルが入るとaiiaを合成するような回路を考えた．
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3.AHL which ingested and LuxR conjugate to activate lux promoter.
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4.GFP which restricted by lux promoter express and turn green.
+
-
1.Sender内でLuxIが発現しAHLが合成される。
+
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2.Senderの細胞膜を通り抜けたAHLはReceiverの細胞の中に取り込まれる。
+
-
3.Receiverに取り込まれたAHLはReceiver内で発現されるLuxRと結合しlux promoterを活性化する。
+
-
4.lux promoter下にあるGFPが発現する。
+
 +
===Exp===
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==Parts Assembly==
 
-
====AHL Positive Feedback aiiA Receiver====
 
-
[[Image:Plux aiiA.jpg|402x45px]]
 
-
====AHL Negative Feedback aiiA Receiver====
 
-
[[Image:Rec inv aiia.jpg|402x45px]]
 
-
==Experiments==
+
===Design2===
-
===AHL生産能力 Assay===
+
[[Image:Rec inv aiia.jpg|402x45px]]<br>
-
====Purpose====
+
図のようにインバーターをかました．
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*To know the absolute number of senders required to activate pLux.
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-
*To know difference in synthesis ability among Strains.
+
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*Precursur of AHL is Methionine.We expect some difference in AHL synthesis add Methionine or not.
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*pLuxをアクティブにするために必要なSenderの絶対数
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*株によるAHL生産能力の違い
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*AHLのprecursurであるMethionineの有無によるAHL生産量の違い
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[[Image:Chiba_ahlsynth.png|frame|'''Fig.'''AHL Synthesis Pathway]]
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[[Image:Chiba AHL test.jpg]]
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====Result====
+
===Exp===
-
 
+
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[[Image:Result AHL test.jpg]]
+
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[[Image:AHL test photo.jpg|320x240px]]
+
-
 
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-
 
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There is no difference between Methionine add or not.
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<Br clear="all">
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+
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===To Make an AHL Concentration Gradient===
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*aiiA (autoinducer inactivation enzyme A):  degradate AHLs．
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*Express aiiA not to diffuse AHL too much. 
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*aiiAを発現させ、AHLが広がりすぎないようにする
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====AHL Positive Feedback aiiA Receiver====
+
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*pluxの下にaiiAをおき、Marimo全体がAHL　quencherとして働くようにする。Marimoの内側でAHLを分解し、Marimoの外側のAHL濃度が上がらないようにする。
+
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*普通のReceiverとともに混ぜて培養すればちょうどいい割合が見つかるかもしれない。
+
-
[[Image:Plux aiiA.jpg|402x45px]]
+
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=====Result=====
+
-
*BBa_T9002との比較ではGFPははじめ発現しないが、しばらくするとGFPが発現するようになる。
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*発現し始めた時が、AHLの濃度がaiiAの分解能力を超えた時だと考えられる。
+
-
 
+
-
====AHL Negative Feedback aiiA Receiver====
+
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*aiiAをpluxとinverterの下に置き、AHLが低い濃度ではaiiAを発現させAHLを分解させ、高い濃度ではaiiAが発現しないような回路を作る。
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-
**thresholdがもっとはっきりするようになるだろう。
+
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[[Image:Rec inv aiia.jpg|402x45px]]
+
-
 
+
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===Improving Sender & Receiver===
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====Super Sender====
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*SenderがもっとAHLを合成するようにする。
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**AHL合成経路でS-adenosyl Methionineのをさらに合成させることでAHLの量を増やす。
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metKを発現するSenderの回路を作る。
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=====Result=====
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あまり変化がないようである。普通のSenderと変わらない。
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・原因
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1.合成されたS-adenosyl Methionineがほかの代謝経路に使われて、AHL合成に使われなかったから。
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2.Genom PCRでMetKを作ったので、mutationが中に入ってしまったから
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====Super Receiver====
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*Receiverをもっと高感度にする。
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**論文で読んだmutant LuxRを作成し、AHLの濃度が低くてもpLuxを活性化する。
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(Collins, C. H., Arnold, F. H. & Leadbetter, J. R. Directed evolution of Vibrio fischeri LuxR for
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increased sensitivity to a broad spectrum of acyl-homoserine lactones. Mol. Microbiol. 55, 712–723
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(2005).)
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LuxRのアミノ酸　Ile45->Phe, Ser116->Ala　この変異を入れ、Sensitiveなレシーバーを作る
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=====Method=====
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Site direct mutagenesisでBBa_T9002に変異を入れる変異を入れる。
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　LuxRに含まれるNcoI,GFPに含まれるHindⅢを利用した方法をとる。
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[[Image:MLuxR.jpg]]
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=====Result=====
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・Ile45->Phe,Ser116->Alaの2か所の変異を入れたものは常にGFPを発現し続けるために、Swichingができなくなってしまった。
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・Ile45->Pheの１か所だけの変異を入れたものを再度作ることにした
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  ・一か所変異を入れたものはwild typeのLuxRを発現するものよりも10倍ほど感度が上がった。
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Revision as of 06:32, 26 October 2007

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Size Control: Our Aim

Fig1.AHL concentration gradient.

（マリモのサイズをコントロールしたい/しなくてはならない：どっち？）マリモのサイズをコントロールする為にはAHLの届く範囲をコントロールできればよい．

  • AHLの届く範囲をコントロールために以下の３つを考えた：
    1. SenderのAHL生産能力をあげる
    2. ReceiverのAHL感受性をあげる
    3. AHL分解酵素aiiAを使う


Improving Sender

Design

Chiba ahlsynth.png

AHLはFig.2のpathwayで合成されている．LuxIは十分量発現していると考えられる（の？）ので，中間体（中間物質？名称わかんない）のs-adenosyl methionineの合成を増やしてみる．その為にmetK遺伝子を増やしてみる．

Experiment

Result

Improving Receiver

Design

File:Mut LuxRの感度アップグラフ mutated LuxRによって感度が上がったという論文があった[ref]．論文によれば1点にmutantをいれた場合〜〜．3点にmutantをいれた場合〜〜． 私たちは〜〜という理由から，そのうちの１点mutantと２点mutantを作った．

Experiment

File:作ったmut luxr 図のように１点＆２点にミュータントをいれたluxrをsite direct mutagenesisで作成した． これを＿＿プラスミドにいれた． ＿＿により感度を見た．

Result

==Aiia==（なんかいいタイトルないか）

Design1

Plux aiiA.jpg
図のように，AHLのシグナルが入るとaiiaを合成するような回路を考えた．

Exp

Design2

Rec inv aiia.jpg
図のようにインバーターをかました．

Exp

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