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	Collins et al,described the hyper-sensitive variants of luxR to AHL:(Ref)<br>		Collins et al,described the hyper-sensitive variants of luxR to AHL:(Ref)<br>
	We created two types of sensitive luxR mutants.		We created two types of sensitive luxR mutants.

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Revision as of 14:05, 26 October 2007

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Size Control: Our Aim

（マリモのサイズをコントロールしたい/しなくてはならない：どっち？）マリモのサイズをコントロールする為にはAHLの届く範囲をコントロールできればよい．

• AHLの届く範囲をコントロールするために以下の３つの方法を考えた：
  1. SenderのAHL生産能力をあげる
  2. ReceiverのAHL感受性をあげる
  3. AHL分解酵素aiiAを使う

1.Improving Sender

Design

AHL is synthesizing from Met via metK/luxR.
We thought combined overexpression of these 2 genes enhances the sender capacity.

AHLはFig.2のpathwayで合成されている．AHLを増加させるためにMetKを過剰発現させ，methionineを加えてみる。

Experiment

Result

No difference seen.

Discussion

• 合成されたS-adenosyl Methionineがほかの代謝経路に使われて、AHL合成に使われなかったのだろうか．

2.Improving Receiver

Design

File:Mut LuxRの感度アップグラフ
Collins et al,described the hyper-sensitive variants of luxR to AHL:(Ref)
We created two types of sensitive luxR mutants.

mutated LuxRによって感度が上がったという論文があった[ref]．論文によれば1点にmutantをいれた場合wildtypeにくらべ10nMでのGPF発現量が増加する．3点にmutantをいれた場合wildtypeのGFP発現の限界が10nMに対して、1.5nMでGFPを発現することができるようになる。
私たちは3つのMutationをそれぞれ一つずつ入れたときは、3つのうち2つがGFPの発現量が多くなっているという理由から，そのうちの１点mutantと２点mutantを作った．

Experiment

File:作ったmut luxr 図のように１点＆２点にミュータントをいれたluxrをsite direct mutagenesisで作成した． これをBBa_t9002プラスミドにいれた． AHLの入ったプレートにより感度を見た．また、蛍光リーダを用いて、10nMでの発現測定した。

Result

• Ile45->Phe,Ser116->Alaの2か所の変異を入れたものは常にGFPを発現し続けるために、Swichingができなくなってしまった。AHLを入れずにGFPを発現。

• 一か所変異を入れたものはwild typeのLuxRを発現するものよりもGFPの発現が多くなった。

3.Aiia

（なんかいいタイトルないかな）

Design1

図のように，AHLのシグナルが入るとaiiaを合成するような回路を考えた．Marimo全体がAHL quencherとして働く．Marimoの内側でAHLを分解し、Marimoの外側のAHL濃度を抑える．

Experiment

Result

• BBa_T9002との比較ではGFPははじめ発現しないが、しばらくするとGFPが発現するようになる。

Discussion

• 発現し始めた時が、AHLの濃度がaiiAの分解る能力を超えた時だと考えられる。

Design2

図のようにインバーターをかませた．高い濃度ではaiiAが発現しないためAHLは分解されない．AHLが低い濃度ではaiiAが発現しAHLを分解する．よってマリモの中心付近ではAHLを分解せず，外側へ行くと分解される．

Experiment

このパーツを作ろうとしたが、inverterを組み合わせた時点で終わってしまった。