Freiburg07/labnotes
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- PCR für Phytochrom und FHY1 Inserts | - PCR für Phytochrom und FHY1 Inserts | ||
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| + | - Expressionskultur von b1_calmo_b2 Gly 4 (XL-1) | ||
Revision as of 18:34, 21 August 2007
Fri, 3rd August 2007
workers: Natalia, Moritz
assessment of the 9 colony o/n cultures with 2,4,6 aa linker calmodulin
Sat, 4th August 2007
Philipp (12-14Uhr):
-Evaluation of the overnight-background-tests with the beta-lactamase/calmodulin-constructs in e.coli
-Centrifugation and labeling of the o/n cultures (of e.coli) containing various iGEM-parts
Mon, 6th August 2007
11 bis 14 Uhr
Anwesend: Corinna, Dario, Kristian, Moritz, Natalia, Philipp
Besprechung der Ergebnisse der letzten Woche
Schnittstellenplanung für spezifische iGEM-Schnittstellen:
- ca. 20% geschafft
blac1-calmodulin-blac2:
- Test für Hintergrund bis zu Amplcilin-Konzentrationen von 200 µl/ml; alle positiv!
PCB-Planung:
- Anfragen für feritges Plasmind per E-Mail; Warten auf Antwort
- Planung für Klonierung aus iGEM-Kit steht, falls wir das Plasmid selbst zusammenbasteln müssen
dhfr1-winzip-dhfr2a:
- Die letzte Sequenzierung zeigte Felher im Konstrukt. Für eine neue Sequenzierung wurden eine anderer Klon gepicked. Die DNA für die nächste Sequenzierung wurde bereits geprept.
Planung Fhy1 und PhyA:
- mögliche Kombinationen wären: dhfr1-Fhy1; PhyA-dhfr2; blac1- Fhy1; PhyA-blac2; Kombinationen mit YFP/CFP werden vielleicht von Urs zusammenkloniert
Planung der Arbeit für die laufende Woche ( 6.8. bis 10.8.2007 )
1. Testverdau und Sequenzierung des Plasmids pFR320dp-blac1-winzip-blac2 (Philipp)
2. Testverdau und Sequenzierung des Plasmids pFR320dp-blac1-calm-blac2 mit 3 verschiedenen Linkerlängen (Natalia, Dario)
3. Primer von PhyA und Fhy1 für PCR planen (Moritz)
4. PCB-Enzyme aus iGEM-Kit zusammenklonieren (Moritz)
5. Reinigung der Konstrukte:
Ansetzten der Übernachtkultur und einer Expressionskultur (Corinna)
Messung der OD und Zellernte (Philipp, Dario)
Dialyse (Philipp, Max)
6. Digitalisierung der Laborjournals (Corinna, Natalia)
7. Hintergrundtest für ein Konstrukt - 4GlyLinker- wiederholen (auf Platten) bei Konzentrationen von 50, 100, 200 und 400 µg/ml Ampicilin (Max)
8. Testverdau und Sequenzierung des Plasmids blac1-winzip-dhfr2 (Dario, Natalia)
Zeitplan der laufenden Woche
Moritz: 9 bis 14 Uhr
Dario: 9 bis 17 Uhr(Mo, Mi, Fr)
Philipp: 17 bis 18 Uhr
Corinna: 18 bis 19 Uhr
Natalia: 9 bis 14 Uhr
Max: ???
Philipp:
Planung und Ansatz des erneuten Testverdaus von dFR320dp-blac1-winzip-blac2, diesmal mit BssSI
Corinna
19.00 Uhr: Verdau-Ansatz von pFR320dp-blac1-winzip-blac2 aus 37 °C-Raum gegholt und Testgel bei 100 V laufen gelassen
20.15 Uhr: Photo von Gel aufgenommen; Auswertung: nur 1 Bande zwischen 2500 und 3000 bp zu erkennen; die eigentlich erwarteten kleineren Banden sind weder auf dem Photo noch im Gel zu erkennen. Evtl. war die eingesetzte DNA-Kontentration zu gering, die große Bande war auch nur relativ schwach zu sehen.
21.00 Uhr: Protokoll des Treffens digitalisiert
Di, 7th August 2007
10 bis 15 Uhr
Moritz: Planung der Klonierung von iGEM Parts für PCB Synthese.
Verdau von folgenden iGEM Parts:
B0034 mit SpeI und PstI (Vektor)
I15008 mit XbaI und PstI (Insert1)
I15009 mit XbaI und PstI (Insert2)
Verdau ab 14 Uhr im 37 Grad Raum!
10 bis 15 Uhr
Natalia:
Plasmidkarten erstellt:
1. pFR320p_b1_2calmo2_b2
2. pFR320p_b1_4calmo4_b2
3. pFR320p_b1_6calmo6_b2
alle Plasmidkarten sind im neuen Ordner bla_calm_bla
Testverdau geplant.
18.30 Uhr
Corinna:
Verdau aus 37 °C-Raum geholt und eingeforen bei -20 °C
Mi, 8th August 2007
Moritz (9 - 15.30 Uhr):
- Planung PhyA und FHY1 PCR
- Prep. Gel für Verdau von iGEM Parts: Vektor und Insert1 bzw. Insert2 ausgeschnitten
- Gelextraktion von Vektor, Insert1 und Insert2
- Konzentrationsbestimmung der geprepten DNA
- Ligation (2Ansätze): Vektor(pSB1A2/B0034) + Insert1(I15008) bzw. Insert2(I15009)
Max (12 - 16.20 Uhr):
- Amplifikation von b1-calmo-b2 Glycerin-stock Zellen
- Vorbereiten von Agar-Platten mit unterschiedlichen AMP Konzentrationenbr( Hintergrundtest)
- Ausstreichen der amplifizierten b1-calmo-b2 zellen auf je 3 Amp-Platten (37°C Raum über Nacht)
Natalia (9-14 Uhr
- Planung und Ansetzen des Testverdaus für pFR320p_b1_#calmo#_b2
- Planung und Ansetzen von Testverdau für Plasmid dFR320_b1_winzip_dhfr2a
Dario (14-18):
- Planung und Ansetzen von Testverdau für Plasmid dFR320_b1_winzip_dhfr2a
- Gellauf des Testverdaus von Plasmid pFR320_b1_#calmo#_b2
- Auswertung des Testgels
Corinna (15-16 Uhr):
- Ansatz einer über-Nacht-Kultur von Zellen mit pFR320dp-blac1-clamo-blac2 (Linkerlänge 4AS) bei 28 °C
Do, 9th August 2007
Gruppenbespechung (12 - 14 Uhr)
Anwesend: Natalia, Corinna, Dario, Moritz, Max, Philipp
Allgemeine Sachen:
- Eppis besser beschriften (Datum, Plasmid/Zellen, wurde Testverdau/Sequenzierung gemacht, bei Fragmenten Enzyme angeben
- Liste von Inhalt der Boxen erstellen (Dario)
- Anlegen einer neue Box nur für Plasmide
Ergebnisse seit dem letzten Treffen und weitere Planung:
1. Testverdau und Sequenzierung pFR320dp-blac1-winzip-blac2:
- unklares Ergebnis; Testverdau wiederholen: aus Glycerinstock eine Über-Nacht-Kultur ansetzten - Miniprep - Verdau (Philipp, Natalia)
2. Testverdau und Sequenzierung pFR320dp-blac1-calmo-blac2:
- unklares Ergebnis; Testverdau mit mehr DNA und mehr Enzym wiederholen, Gel nicht zu lange laufen lassen
3. Primer für PhyA und Fhy1: läuft (Moritz)
4. PCB: läuft (Moritz)
5. Reinigung des Konstrukts blac1-4-calmo-4-blac2:
- kaum Wachstum in der Über-Nacht-Kultur; angeimpfte Expressionskultur wächst ebenfalls sehr langsam
mögliche Erklärungen: falsches Plasmid, falsche CAM-Konzentration, Temperaturabhängigkeit (28 °C!) der Plasmidkopien, XL-1 blue, toxisches Produkt; Zellen wachsen anscheinend sehr langsam
Sonntag: von allen 3 Konstrukten Über-Nacht-Kulturen von Klon 1 ansetzen (Corinna)
6. Digitalisierung: läuft (Natalia, Corinna)
7. Hintergrund-Test (AMP):
- Wachstum bei allen Konstrukten und allen getesteten Konzentrationen, konstitutive Aktivität?
8. Testverdau und Sequenzierung pFR320dp-blac1-winzip-dhfr2: Gel wird gerade ausgewertet (Dario)
neues Projekt:
- kleines Lactamase-Fragment aus dem Plasmid entfernen (Umklonierung)
Moritz (9.30 - 15 Uhr):
- Transformation der Ligation in RV 308 (chem. kompetent):
es wurde die Ligationen Vektor + Insert1 (pSB1A2/B0034 + I15008),
sowie Vektor + Insert2 (pSB1A2/B0034 + I15009) transformiert.
- Besprechung mit Kristian wegen Primern für FHY1 und PhyA:
es besteht noch weiterer Planungsbedarf da die Primer kompliziert aufgebaut sind :-P !!!!
Corinna (8.00 - 9.30 Uhr):
- In der über-Nacht-Kultur war in einem Ansatz nur eine sehr geringe Trübung als Zeichen für Wachstum zu erkennen, im anderen Ansatz war das Medium sogar noch klar.
- Trotzdem: Ansatz der Expressionskultur für die anschleißende Reinigung des Konstrukts blac1-4calmo4-blac2
Dario (8.30 - 16 Uhr):
- Gel laufen lassen von Testverdau für Plasmid dFR320_b1_winzip_dhfr2a mit KpnI und AflIII, Auswertung zeigte
die von uns geplannte Banden
- Gellauf des Testverdaus von Plasmid pFR320_b1_#calmo#_b2 ausgewertet und die von uns geplanten Banden
waren nicht zu erkennen, mögliche Fehlern: Gel zu lang laufen lassen oder Volumen an Plasmid
- Wiederholung von Testverdaus von Plasmid pFR320_b1_#calmo#_b2 mit SpeI und KpnI. Noch nicht ausgewertet
- Messung von Optische Dichte (OD) von Expressionskultur pFR320p_blac1_4calmo4_blac2 (von Corinna):
OD Werte waren sehr niedrig und ist gar nicht gewachsen. Muss wiederholt werden. Wird wahrscheinlich
mit pFR320p_blac1_2calmo2_blac2 wiederholt
Max (12 - 16Uhr):
- Auszählen der verschieden konzentrierten AMP platten mit b1-calmo-b2 konstrukten ergab, dass alle platten
übertrieben bewachsen wahren und keine Aussage über die Funktionalität der unterschiedlichen Konstrukte
getroffen werden konnte. Grund dafür ist wohl fehlerhaftes Ampicilin , dass für die Platten verwendet wurde!
- Ansetzen von 20 1ml Aliquots Ampicilin (100 mg/ml) für neue platten und verdünnungstestreihe der konstrukte
Philipp (12-16Uhr):
- Ansatz der ÜNK von Klon B1 (Glycerinstock) zur Auffrischung des Bestandes an pFR320dp-blac1-winzip-blac2
-Verschiedene kleinere Arbeiten (Etikettieren, Boxen, Auswertung...)
Fr, 10th August 2007
Moritz (9 - 14 Uhr):
- Ansetzen einer Übernachtkultur von Trafo - Platten:
Die Platten waren dich bewachsen! Es könnte sich um Platten mit fragwürdigem Amp handeln (leider habe ich es zu spät gemerkt) und dadurch könnten die Colis (RV 308) das Plasmid verloren haben!! Die Vermutung liegt nahe, da in der ÜNK noch keine Zeichen von Wachstum zu erkennen sind (nach 3,5 Stunden).
- Planung der Primer (PhyA u. FHY1) fast abgeschlossen (werden noch mit gcg ausgewertet und Kristian muss noch sein OK geben).
Max (13.30 - 16.30 ):
- Aufzucht von b1-calmo-b2 zellen mit 2,4 und 6 Glycinen linker aus den Glycerin stocks für 1 Stunde
- Giessen neuer Platten mit je 25µg CM und 50µg, 100µg, 200µg sowie 400µg Amp, für eine neue Verdünnungs-testreihe
- Ausplattieren der angereicherten b1-calmo-b2 Zellen auf den Platten; Bebrütung bei 37°C über Nacht
Natalia (9-14Uhr)
- Plasmid dFR320d_b1_wz_dhfr2 zum Sequenzieren abgegeben
- ÜNK geprept und die Konzentration bestimmt
- Bestimmung der Konzentration von der Expressionskultur
Corinna (15.00 - 17.00 Uhr):
- Kulturen (von Moritz) aus 37 °C-Raum geholt. In allen 6 RGs sind die Zellen gewachsen.
- Anlegen von Glycerin-Stocks
- Miniprep von allen Proben
Sa, 11th August 2007
Max (12.30 - 14.00 uhr):
- Auszählen der Platten mit den unterschiedlichen Amp Konzentrationen; Dabei war ein Trend der Zellen mit 2- und 6 Glycinen Linker zu erkennen, bei höheren Amp konzentrationen schlechter zu wachsen! Die Zellen mit 4 Glycinen als Linker zeigten überhaupt kein wachstum auf 50, 200 und 400 µg Amp wobei auf 100 µg nur 4 veeinzelte klone zu sehen waren. Mit Klon 1 b1- 4calmo4 -b2 sollte eine weitere Verdünnungsreihe unter Zugabe verschiedener Calciumtiter durchgeführt werden!
So, 12th August 2007
Corinna: (13.00 -14.15 Uhr)
- Ansatz von Ü/N-Kulturen aus Glycerinstocks von Zellen mit allen 3 Linkerlängen (immer Klon 1 verwendet)bei 28 °C; es soll das Wachstum beobachtet werden, da bei der letzten Ü/N-Kultur (Linkerlänge 4 AS)nach über 16 h kaum Zellen gewachsen sind.
Mo, 13th August 2007
Besprechung (12.00 bis 14.00 Uhr)
Folgende Probleme wurden festgestellt:
1. Testverdau der blac1-calmo-blac2 Konstrukte zeigt nur religierten Vektor
- neue Ligation von pFR320dp-blac1-winzip-blac2 und Calmodulin aus PCR (KpnI und SpeI)
- anschließende Transformation
- je 6 Klone von der Platte picken, davon je 3 prepen
- Testverdau von insgesamt 9 Klonen
- Kontrolle der bisherigen Arbeitz für dieses Konstrukt:
05.7.07 - Testverdau von pFR320dp-blac1-winzip-blac2
20.7.07 - Sequenzierung
26.7.07 - PCR für Calmodulin; Verdau des Vektors mit KpnI und SpeI
27.7.07 - Reinigung Calmodulin
31.7.07 - Testverdau pFR320dp-blac1-winzip-blac2, B.2 Klon zeigte richtige Sequenz; Ligation
01.8.07 - Transformation in RV308 und XL-1
02.8.07 - Auswertung der Transformation; Picken und ansetzen von über-Nacht-Kultur
03.8.07 - Spinprep
2. Klone wachsen im Flüssigmedium, aber nicht auf Platten
Weitere Schritte:
- Verdau des Vektors pFR320dp-blac1-w-blac2
- PCR dhfr1 für pFR320-blac1-winzip dhfr2
Moritz (9-14.30 Uhr):
- Preparativer Verdau von Vektor1 (Plasmid mit PBAD) und Insert1 (Plasmid mit RBS + HO1)
- Preparativer Verdau von Vektor2 (Plasmit mit Terminator) und Insert2 (Plasmit mit RBS + PcyA)
Enzyme: Vektor1 mit SpeI, PstI. Insert I mit PstI, XbaI. Vektor2 mit EcoRI, XbaI. Insert2 mit EcoRI, SpeI.
Natalia (11.00 - 11.30)
- Ansetzen neuer Expressionskultur
Max (12.30 - 16.30 uhr):
- Präperativer Verdau des pFR 320p b1- wz -b2 Vektors mit SpeI und KpnI
- Planung und Ansetzen einer PCR für dass Dhfr1 - Fragment aus dem ausgangsvektor Nr. 183
- sich aufgeregt
Di, 14th August 2007
Moritz (10-13 Uhr)
- Prep. Gel: Auswertung hat mich dazu veranlasst mit der Klonierung der iGEM Parts von weiter vorne neu zu beginnen!!!
- Ligation(2Ansätze): Vektor(pSB1A2/B0034) + Insert1(I15008) bzw. Insert2(I15009)
Max (12 - 16 Uhr):
- Laufen des Präperativen Gels mit dem Dhfr- Fragment 1 sowie dem präperativen Verdau von Vektor
pFR 320p b1- wz -b2
- Die Auswertung des Gels war positiv und es konnten die gewünschten Banden eluiert werden
- Der Vektor pFR 320p b1- wz -b2 wird vor der Ligation mit den Calmodulin Konstrukten Dephosphoryliert (Natalia)
- wieder aufgeregt
Natalia (11:00 -12:00; 14:30 - 18:00)
- OD der Expressionskultur gemessen
- Dephosphorylierung des Vektors: pFR320p_b1_wz_b2
- Ligation der Calmodulinkonstrukte
- Präparativer Verdau von dhfr1
Mi, 15th August 2007
Moritz (9.30- 17.30 Uhr):
- Transformation der Ligation (Ligation(2Ansätze): Vektor(pSB1A2/B0034) + Insert1(I15008) bzw. Insert2(I15009))
- die Primer für PhyA und FHY1 müssen mal wieder neu geplant werden, da wir die iGEM kompatiblen Parts über Gensynthese bestellen und den Rest nur für uns machen (ohne iGEM Schnittstellen!!!)
Dario (12.00 bis 18 Uhr):
- Reinigung der PCR-Produkte von Dhfr1-Fragment
- Moritz helfen beim Digitalisirung der PhyA und FHY1 Primer Sequenzen
Natalia (9:30 - 12:00)
- Transformation der Ligation vom 14/08/07
- Vektorverdau b1_wz_dhfr2 angesetzt
Do, 16th August 2007
Moritz (9.30 - 15.30 Uhr):
- ÜNK der Transformation (pSB1A2/B0034/I15008 bzw. pSB1A2/B0034/I15009), wenns denn funktioniert hat.
- Fertigstellung der Primer (nach 1000 Jahren) und Bestellung bei Käptäääään Igloi
Natalia (9:30 - 15:30)
- Gel laufen lassen mit dem Verdau vom 15/08/07
- Banden ausgeschnitten und anschließend gereinigt
- Auswertung der Trafo-Platten
- Ligation von b1_wz_dhfr2-Vektor + Insert (dhfr1), zusätzlich eine Negativ-Probe
Max (12 - 16 uhr):
- von den b1- #calmo# -b2 transformationsplatten vom 15/08/07 wurden je 3 klone gepickt und Übernachtkulturen mit diesen angesetzt
- Vorbereiten neuer AMP - Verdünnungsplatten mit 50, 100, 200 und 400µg AMP sowie je 25µg CM pro Platte (im 4°C Raum bis zur verwendung aufbewahrt!)
Fr, 17th August 2007
Moritz (9.30 12 Uhr):
- Spin Prep der ÜNK und Anlegen von Glycerin Stock
Natalia (10 - 12.30 Uhr):
- Transformation von Plasmid mit dhfr1-winzip-dhfr2br
Max Vormittag (10 - 13.45 uhr):
- Von den Übernachtkulturen vom 16/08/07 der unterschiedlichen Calmodulin - Konstrukte ( 2, 4 und 6 Glycine linker) wurde jeweils ein Glycerinstock angelegt
- Klon Nr 3 jedes Konstruktes ( 2, 4 und 6 Glycine linker) wurde nur runterzentrifugiert und dass pellet so eingefroren
- Klon Nr 2 und Nr 1 wurden mit QIAGEN Plasmid mimiprep-kit bearbeitet und so die Plasmid DNA eluiert, mit welcher anschliessend ein Testverdau mit KpnI und SpeI angesetzt wurde
- nicht mal richitg aufgeregt
Nachmittag (16 - 19 uhr):
- Ansetzen von 2 mL Kulturen der Glycerinstocks b1 - calmo - b2 (mit 2, 4 und 6 Glycinen) um diese im Fall eines positiven Testverdaus auszuplattieren
- Gellauf des Testverdaus für 45 Minuten; Im Gel waren ausschliesslich die gewünschten Banden zu erkennen, woraus sich schliessen lässt dass die Ligation diesmal erfolgreich war!
- Ausplattieren von Klon Nr 1 der hochgezogenen Zellen (ca 1 Stunde Wachstum!) auf den AMP - Verdünnungsplatten vom 16/08/07; Bebrütung bei 37° über Nacht (Platten dabei immer auf den Kopf stellen!)
Mo, 20th August 2007
Max (12 - 14 uhr):
- Auszählen der AMP - Verdünnungsplatten vom 17/08/07; Nur der Klon mit 2 Glycinen Linker zeigte auf der Platte mit 50 µg 46 Kolonien, auf der Platte mit 100 µg wuchs eine einzelne kolonie. Alle anderen Platten waren vollkommen unbewachsen, woraus sich schliessen lässt, dass diese Klone nicht in der Lage sind AMP abzubauen!
- Ansetzen einer 50 mL ÜNK des Klons Nr 1 mit 4 Glycinen Linker als Expressionskultur
- Abgabe der Calmodulin Konstrukte mit 2, 4 und 6 Glycinen Linker zum Sequenzieren; Es wurde hierfür immer Klon Nr 1 abgegeben; Auswertung sollte nach Möglichkeit bitte jemand anders machen, da ich ab morgen auf Urlaub bin;)
Di, 21th August 2007
Moritz (12-19.30):
- PCR für Phytochrom und FHY1 Inserts
Dario (12-20:30):
- Expressionskultur von b1_calmo_b2 Gly 4 (XL-1)
