From 2007.igem.org

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Our Goal:Marimoをつくる

• 鞭毛間吸着テスト
• 有限確認テスト
• りんご飴アッセイ

(As Final-Construction, we carry out three experiments. First, a test of adsorption between flagella. The purpose of this test is confirming adsorption between senders and receivers with His-Tag. Second, a test to confirm a limit of size. The purpose of this test is to confirm that Marimo has a limit of size. Third, a test to form Marimo!)

鞭毛間吸着test

senderとreceiver同士がHis-Tagで吸着しているかを確認するためのテストである。

1.Senderとreceiverをそれぞれ培養し、receiverの培養液の中に、senderを１滴加える。
2.その中に金属イオンを加えると、senderとreceiverが鞭毛同士で吸着し始める。
3.ある程度吸着したら、imidazolを加えたものとそうでないものをプレートにまく。
4.imidazolを加えたものはばらばらのコロニーができ、imidazolなしのものは、senderとreceiverが
  くっついているので、くっついたコロニーができる。

(First, we carry out a test of adsorption between flagella. We culture senders and receivers in a test tube. Then, we drop senders into receivers and mix cobalt ion. They start to aggregate because of they have His-Tag. After aggregation, we divide it into two groups. One is added imidazole and the other is non imidazole. We inoculate them on the plates. Cultures added imidazole form sender’s colony and receiver’s colony. The other (non imidazole) form colonies adsorbed senders and receivers. If we succeed, we show that senders and receivers aggregate with His-Tag.)

有限確認test

マリモを作る前の段階として、マリモの成長が有限の大きさで止まるか２次元で確認するためのテストである。

1.senderとreceiverを試験管でそれぞれ培養する。
2.receiverをプレートに均一にまき、senderを真ん中に少量スポットし一晩培養する。
3.senderの近く（GFPを発現している)、中間、遠く（GFPを発現していない）から数箇所ずつ菌をとってそれぞれ希釈液を作る。
4.希釈した菌にCo2+を加えてプレートにまく。
5.FliCを発現していなかったreceiverは、ばらばらのコロニーを作り、FliCを発現していたreceiverは塊になったコロニーを作る。

(First, we culture senders and receivers in a test tube. Next, we inoculate receivers equally on the plate, and drop senders at the center of it. After over night, we pick colonies which are near the senders (colonies express GFP), the end of the circle expressed GFP, and out of the green circle. Then, we dilute them .

　

りんご飴アッセイ

ついに毬藻を作る！！！

• AHLはとても小さな分子で、自由度が高いので、拡散するのが早い。

キャピラリーを利用することによって、senderが生産するAHLの拡散を遅くし、AHLの濃度勾配を作ることができる。濃度勾配によってより球体に近いマリモができる。

1.receiverとsenderを一晩培養する。Receiverの培養液の中にはコバルトイオンをまぜておく。
2.キャピラリーでsenderを吸い取り、receiverの培養液の中に加える。
3.Senderの出したAHLが拡散し始める。
4.ReceiverはAHLを感じてGFPを発現する。また鞭毛を生やし、Ni２＋を介してHisタグ同士で吸着し始める。
5.集合が成長してマリモになる。

Discussion

Future

サイズ制御

• senderとreceiverの量を変えて様々なサイズのマリモを作る

motto Future!!!!!

• サイズをもっと大きくしてマリモでキャッチボールがしたい
• リポソームの中でマリモを作る
• 大腸菌マリモをえびちゃんと共生