From 2007.igem.org

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Our Goal:Making Marimo

As Final-Construction, we carry out three experiments.

• A test of adsorption between flagella
• A test to confirm a limit of size
• A test to form Marimo

A test of adsorption between flagella

senderとreceiver同士がHis-Tagで吸着しているかを確認するためのテストである。(The purpose of this test is confirming adsorption between senders and receivers with His-Tag.)

1.Senderとreceiverをそれぞれ培養し、receiverの培養液の中に、senderを１滴加える。
2.その中に金属イオンを加えると、senderとreceiverが鞭毛同士で吸着し始める。
3.ある程度吸着したら、imidazolを加えたものとそうでないものをプレートにまく。
4.imidazolを加えたものはばらばらのコロニーができ、imidazolなしのものは、senderとreceiverが
  くっついているので、くっついたコロニーができる。

(First,we culture senders and receivers in a test tube. Then, we drop senders into receivers and mix cobalt ion. They start to aggregate because of they have His-Tag. After aggregation, we divide it into two groups. One is added imidazole and the other is non imidazole. We inoculate them on the plates. Cultures added imidazole form sender’s colony and receiver’s colony. The other (non imidazole) form colonies adsorbed senders and receivers. If we succeed, we show that senders and receivers aggregate with His-Tag.)

A test to confirm a limit of size

マリモを作る前の段階として、マリモの成長が有限の大きさで止まるか２次元で確認するためのテストである。(The purpose of this test is to confirm that Marimo has a limit of size. )

1.senderとreceiverを試験管でそれぞれ培養する。
2.receiverをプレートに均一にまき、senderを真ん中に少量スポットし一晩培養する。
3.senderの近く（GFPを発現している)、中間、遠く（GFPを発現していない）から数箇所ずつ菌をとってそれぞれ希釈液を作る。
4.希釈した菌にCo2+を加えてプレートにまく。
5.FliCを発現していなかったreceiverは、ばらばらのコロニーを作り、FliCを発現していたreceiverは塊になったコロニーを作る。

(First, we culture senders and receivers in a test tube. Next, we inoculate receivers equally on the plate, and drop senders at the center of it. After over night, we pick colonies which are near the senders (colonies express GFP), the end of the circle expressed GFP, and out of the green circle. Then, we dilute them . Next, we mix cobalt ion into dilutions and inoculate on the plates. Receivers which don’t express FliC (they didn’t sense AHL and express GFP) form colonies one by one. Receivers expressed FliC (they sensed AHL and expressed GFP) form aggregated colonies.)

　

A test to form Marimo

ついに毬藻を作る！！！ (We finally make Marimo!!)

• AHLはとても小さな分子で、自由度が高いので、拡散するのが早い。

キャピラリーを利用することによって、senderが生産するAHLの拡散を遅くし、AHLの濃度勾配を作ることができる。濃度勾配によってより球体に近いマリモができる。

1.receiverとsenderを一晩培養する。Receiverの培養液の中にはコバルトイオンをまぜておく。
2.キャピラリーでsenderを吸い取り、receiverの培養液の中に加える。
3.Senderの出したAHLが拡散し始める。
4.ReceiverはAHLを感じてGFPを発現する。また鞭毛を生やし、Ni２＋を介してHisタグ同士で吸着し始める。
5.集合が成長してマリモになる。

Discussion

Future

サイズ制御

• senderとreceiverの量を変えて様々なサイズのマリモを作る

motto Future!!!!!

• サイズをもっと大きくしてマリモでキャッチボールがしたい
• リポソームの中でマリモを作る
• 大腸菌マリモをえびちゃんと共生