Chiba/Quorum Sensing
From 2007.igem.org
|
Introduction | Project Design ( 1.Sticky Hands | 2.Communication | 3.Size Control ) | Making Marimos | Our Goal || Team Members | メンバ連絡簿 |
Size Control: Our Aim
（マリモのサイズをコントロールしたい/しなくてはならない：どっち？）マリモのサイズをコントロールする為にはAHLの届く範囲をコントロールできればよい．
- AHLの届く範囲をコントロールするために以下の３つの方法を考えた：
- SenderのAHL生産能力をあげる
- ReceiverのAHL感受性をあげる
- AHL分解酵素aiiAを使う
1.Improving Sender
Design
AHL is synthesizing from Met via metK/luxR.
We thought combined overexpression of these 2 genes enhances the sender capacity.
AHLはFig.2のpathwayで合成されている．AHLを増加させるためにMetKを過剰発現させ，methionineを加えてみる。
Experiment
Result
No difference seen.
Discussion
- 合成されたS-adenosyl Methionineがほかの代謝経路に使われて、AHL合成に使われなかったのだろうか．
2.Improving Receiver
Design
mutated LuxRによって感度が上がったという論文があった[ref]．論文によれば1点にmutantをいれた場合wildtypeにくらべ10nMでのGPF発現量が増加する．3点にmutantをいれた場合wildtypeのGFP発現の限界が10nMに対して、1.5nMでGFPを発現することができるようになる。 私たちは3つのMutationをそれぞれ一つずつ入れたときは、3つのうち2つがGFPの発現量が多くなっているという理由から，そのうちの１点mutantと２点mutantを作った．
Experiment
File:作ったmut luxr 図のように１点＆２点にミュータントをいれたluxrをsite direct mutagenesisで作成した． これをBBa_t9002プラスミドにいれた． AHLの入ったプレートにより感度を見た．また、蛍光リーダを用いて、10nMでの発現測定した。
Result
- Ile45->Phe,Ser116->Alaの2か所の変異を入れたものは常にGFPを発現し続けるために、Swichingができなくなってしまった。AHLを入れずにGFPを発現。
- 一か所変異を入れたものはwild typeのLuxRを発現するものよりもGFPの発現が多くなった。
3.Aiia
（なんかいいタイトルないかな）
Design1
図のように，AHLのシグナルが入るとaiiaを合成するような回路を考えた．Marimo全体がAHL quencherとして働く．Marimoの内側でAHLを分解し、Marimoの外側のAHL濃度を抑える．
Experiment
Result
- BBa_T9002との比較ではGFPははじめ発現しないが、しばらくするとGFPが発現するようになる。
Discussion
- 発現し始めた時が、AHLの濃度がaiiAの分解る能力を超えた時だと考えられる。
Design2
図のようにインバーターをかませた．高い濃度ではaiiAが発現しないためAHLは分解されない．AHLが低い濃度ではaiiAが発現しAHLを分解する．よってマリモの中心付近ではAHLを分解せず，外側へ行くと分解される．
Experiment
このパーツを作ろうとしたが、inverterを組み合わせた時点で終わってしまった。
