Chiba/Quorum Sensing
From 2007.igem.org
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Our Aim
1.FliC His-tagをただ発現させるだけではなく、Quorum Sensingをpositive feedbackのスイッチとして利用する。 2.aiiAをAHL quencherとして利用し、AHLの濃度勾配をつくりだすAsseyにする。 3.inverterでaiiAのthresholdをはっきり出すような遺伝子回路の設計 4.Quorum SensingのSensing能力の向上
About Quorum Sensing
クオラムセシングの説明
SenderはLuxIを発現するSenderはAHLを合成する。細胞膜を通り抜け細胞外にAHLは拡散していく。
ReciverはLuxRを発現しLux promoterを含む遺伝子回路を持つ。細胞膜を通り抜けてきたAHLはLuxRと結合して、Lux promoterを活性化する。
上の回路では
1.Sender内でLuxIが発現しAHLが合成される。 2.Senderの細胞膜を通り抜けたAHLはReceiverの細胞の中に取り込まれる。 3.Receiverに取り込まれたAHLはReceiver内で発現されるLuxRと結合しlux promoterを活性化する。 4.lux promoter下にあるGFPが発現する。
Parts Assembly
AHL Positive Feedback aiiA Receiver
AHL Negative Feedback aiiA Receiver
Experiments
AHL生産能力 Assay
Quorum Sensingをスイッチとして利用するために以下の実験をした。
- pLuxをアクティブにするためにはどのくらいのSenderが必要なのだろうか
- SenderとしてAHLを生産する能力の高い株は？（SenderとしてLuxIを発現する株はどのようなものがいいのか）
- AHLのprecursurであるMethionineを培地に加えることで，Senderはより多くのAHLを合成するのだろうか？
Fig.AHL Synthesis Pathway
Result
To Make an AHL Concentration Gradient
- aiiA (autoinducer inactivation enzyme A): degradate AHLs．
- aiiAを発現させ、AHLが広がりすぎないようにする
AHL Positive Feedback aiiA Receiver
- pluxの下にaiiAをおき、Marimo全体がAHL quencherとして働くようにする。Marimoの内側でAHLを分解し、Marimoの外側のAHL濃度が上がらないようにする。
- 普通のReceiverとともに混ぜて培養すればちょうどいい割合が見つかるかもしれない。
AHL Negative Feedback aiiA Receiver
- aiiAをpluxとinverterの下に置き、AHLが低い濃度ではaiiAを発現させAHLを分解させ、高い濃度ではaiiAが発現しないような回路を作る。
- thresholdの境がもっとはっきりするようになるだろう。
Improving Sender & Receiver
Super Sender
- SenderがもっとAHLを合成するようにする。
- AHL合成経路でS-adenosyl Methionineのをさらに合成させることでAHLの量を増やす。
metKを発現するSenderの回路を作る。
Result
あまり変化がないようである。普通のSenderと変わらない。
・原因 1.合成されたS-adenosyl Methionineがほかの代謝経路に使われて、AHL合成に使われなかったから。 2.Genom PCRでMetKを作ったので、mutationが中に入ってしまったから
Super Receiver
- Receiverをもっと高感度にする。
- 論文で読んだmutant LuxRを作成し、AHLの濃度が低くてもpLuxを活性化する。
(Collins, C. H., Arnold, F. H. & Leadbetter, J. R. Directed evolution of Vibrio fischeri LuxR for increased sensitivity to a broad spectrum of acyl-homoserine lactones. Mol. Microbiol. 55, 712–723 (2005).)
LuxRのアミノ酸 Ile45->Phe, Ser116->Ala この変異を入れ、Sensitiveなレシーバーを作る
Method
Site direct mutagenesisでBBa_T9002に変異を入れる変異を入れる。
LuxRに含まれるNcoI,GFPに含まれるHindⅢを利用した方法をとる。
Result
・Ile45->Phe,Ser116->Alaの2か所の変異を入れたものは常にGFPを発現し続けるために、Swichingができなくなってしまった。 ・Ile45->Pheの１か所だけの変異を入れたものを再度作ることにした ・一か所変異を入れたものはwild typeのLuxRを発現するものよりも10倍ほど感度が上がった。
