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Our Goal:Making Marimo

As Final-Construction, we carry out four experiments.

• A test of adsorption between flagella
• A test to confirm a limit of size
• A test to form Marimo
• A test of size control

A test of adsorption between flagella

Purpose

Confirm adsorption between senders and receivers with His-Tag.

senderとreceiver同士がHis-Tagで吸着しているかを確認するためのテスト

Method

1. Culture senders and receivers in a test tube.
2. Drop senders into receivers and mix cobalt ion.
3. Divide it into two groups. One is added imidazole and the other is non imidazole. Inoculate them on the plates.
4. Check the colony. If succeeded, cultures which is added imidazole will form a indipendent colony of senders&receivers. The other (non imidazole) will form colonies of adsorbed senders and receivers.

1.Senderとreceiverをそれぞれ培養し、receiverの培養液の中に、senderを１滴加える。
2.その中に金属イオンを加えると、senderとreceiverが鞭毛同士で吸着し始める。
3.ある程度吸着したら、imidazolを加えたものとそうでないものをプレートにまく。
4.imidazolを加えたものはばらばらのコロニーができ、imidazolなしのものは、senderとreceiverが
  くっついているので、くっついたコロニーができる。

A test to confirm a limit of size

Purpose

マリモを作る前の段階として、マリモの成長が有限の大きさで止まるか２次元で確認するためのテストである。(The purpose of this test is to confirm that Marimo has a limit of size. )

Method

1. We culture senders and receivers in a test tube.
2. we inoculate receivers equally on the plate, and drop senders at the center of it.
3. After over night, we pick colonies which are near the senders (colonies express GFP), the end of the circle expressed GFP, and out of the green circle.
4. we dilute them .
5. we mix cobalt ion into dilutions and inoculate on the plates.
6. Receivers which don’t express FliC (they didn’t sense AHL and express GFP) form colonies one by one.
7. Receivers expressed FliC (they sensed AHL and expressed GFP) form aggregated colonies.)

1.senderとreceiverを試験管でそれぞれ培養する。
2.receiverをプレートに均一にまき、senderを真ん中に少量スポットし一晩培養する。
3.senderの近く（GFPを発現している)、中間、遠く（GFPを発現していない）から数箇所ずつ菌をとってそれぞれ希釈液を作る。
4.希釈した菌にCo2+を加えてプレートにまく。
5.FliCを発現していなかったreceiverは、ばらばらのコロニーを作り、FliCを発現していたreceiverは塊になったコロニーを作る。

　

A test to form Marimo

Purpose

ついに毬藻を作る！！！ (We finally make Marimo!!)

• AHLはとても小さな分子で、自由度が高いので、拡散するのが早い。
• キャピラリーを利用することによって、senderが生産するAHLの拡散を遅くし、AHLの濃度勾配を作ることができる。濃度勾配によってより球体に近いマリモができる。

Method

1.receiverとsenderを一晩培養する。Receiverの培養液の中にはコバルトイオンをまぜておく。
2.キャピラリーでsenderを吸い取り、receiverの培養液の中に加える。
3.Senderの出したAHLが拡散し始める。
4.ReceiverはAHLを感じてGFPを発現する。また鞭毛を生やし、Ni２＋を介してHisタグ同士で吸着し始める。
5.集合が成長してマリモになる。

A test of size control

Purpose

senderとreceiverの量を変化させることによって、まりものサイズを制御するためのテスト。

Method

1. senderとreceiverを培養する。
2. senderの量を一定にして、receiverの種類・量を変化させ、まりもの大きさの変化をみる。
3. receiverの量を一定にして、senderの量を変化させ、マリモの大きさの変化をみる。

Future

• サイズをもっと大きくしてマリモでキャッチボールがしたい
• リポソームの中でマリモを作る