From 2007.igem.org

Introduction | Project Design | Engeneering Flagella | Quorum Sensing | Our Goal || Team Members | メンバ連絡簿

大腸菌同士を吸着させるため，我々は（細胞の外側に突出しているもののうち）鞭毛に着目した． （図：イメージ）

About flagella（鞭毛についての説明）

大腸菌は5~10?本/細胞（＜chemotaxisの本で要確認）の鞭毛を持つ．鞭毛を回転/逆回転させることにより環境の良い場所へとtaxisする．鞭毛は長さ約10~15μm，半径約23nmの空孔のチューブ状である．（図：菌全体）

鞭毛のフィラメント部はFliCという蛋白質が規則正しく配列した多量体である．（図：鞭毛アップ）

FliCはD0,D1,D2,D3ドメインを持つ．(種類によってはD1,D2,D3の３つのドメインを持つ)D1とD2はformation of the functional flagellar formation(ffff)の為に必要であるが，D3ドメインは必要でなく可変である（図：蛋白質構造＆鞭毛断面図）

(Ref)

"variable" FliC D3 domain

可変なD3ドメインに他の＜__aaまでの＞アミノ酸を挿入しても鞭毛が合成される[2]. 詳細も書く．

References

1. Kuwajima, G. et al.: Nature Biotechnology, 6, 1080-1083 (1988).
2. Tanskanen, J. et. al.: Appl. and Env. Microbiol., 4152-4156 (2000)

Our Projet: insert his-tag into the flagellin

FliC-hisの作成

• pUC19 vectorにFliCをコードする遺伝子を挿入→pUC19-FliC
• FliCの可変領域のうち、フィラメントの外側部分から５か所を選び、プライマーを設計(207,228,240,252,267)し、エキサイトPCR→pUC19-FliC vector
• EcoRⅠSite,2×Ser,6×His,2×Ser,NcoⅠ siteをコードするオリゴをデザイン。

(six histidine loop peptide ("His-loop")(containing imidazole side chain), -Ser-Ser-His-His-His-His-His-His-Ser-Ser,encoded by the oligo 5'-TCT-TCT-CAT-CAT-CAT-CAT-CAT-CAT-TCC-TCC-3' and anti oligo 5'-GGA-GGA-ATG-ATG-ATG-ATG-ATG-ATG-AGA-AGA-3')

• pUC19-FliC vector と6×Hisオリゴをライゲーション.

Experiments

Phenotype Check: SDS-PAGE,Western-Blotting

1. pUC19-FliC-267His,pET-49bをKeio⊿FliC株にトランスフォーメーション.
2. pick colony→preculture 2mL M9 Medium.
3. add IPTG 2mL

Display Check: Swarming test

Display Check: Beads Adsorption

• pUC19-FliC-His(Keio⊿FliC株),no-plasmid(Keio⊿FliC株)

Co2+,Ni2+有り・無しでビーズ吸着→吸着しない

• pUC19-FliC-His(Keio⊿FliC株・⊿motB),no-plasmid(Keio⊿FliC株・⊿motB)

co2+,Ni2+有り無しでビーズ吸着→吸着した

• Beads adsorption Protocol