Chiba/Engeneering Flagella
From 2007.igem.org
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大腸菌同士を吸着させるため,我々は(細胞の外側に突出しているもののうち)鞭毛に着目した. (図:イメージ)
About flagella(鞭毛についての説明)
大腸菌は5~10?本/細胞(<chemotaxisの本で要確認)の鞭毛を持つ.鞭毛を回転/逆回転させることにより環境の良い場所へとtaxisする.鞭毛は長さ約10~15μm,半径約23nmの空孔のチューブ状である.(図:菌全体)
鞭毛のフィラメント部はFliCという蛋白質が規則正しく配列した多量体である.(図:鞭毛アップ)
FliCはD0,D1,D2,D3ドメインを持つ.(種類によってはD1,D2,D3の3つのドメインを持つ)D1とD2はformation of the functional flagellar formation(ffff)の為に必要であるが,D3ドメインは必要でなく可変である(図:蛋白質構造&鞭毛断面図)
(Ref)
"Variable" FliC D3 domain
可変なD3ドメインに他の<__aaまでの>アミノ酸を挿入しても鞭毛が合成される[2]. 詳細も書く.
References
- Kuwajima, G. et al.: Nature Biotechnology, 6, 1080-1083 (1988).
- Tanskanen, J. et. al.: Appl. and Env. Microbiol., 4152-4156 (2000)
Parts Assembly
FliC-hisの作成
- pUC19 vectorにFliCをコードする遺伝子を挿入→pUC19-FliC
- FliCの可変領域のうち、フィラメントの外側部分から5か所を選び、プライマーを設計(207,228,240,252,267)し、エキサイトPCR→pUC19-FliC vector
- EcoRⅠSite,2×Ser,6×His,2×Ser,NcoⅠ siteをコードするオリゴをデザイン。
(six histidine loop peptide ("His-loop")(containing imidazole side chain), -Ser-Ser-His-His-His-His-His-His-Ser-Ser,encoded by the oligo 5'-TCT-TCT-CAT-CAT-CAT-CAT-CAT-CAT-TCC-TCC-3' and anti oligo 5'-GGA-GGA-ATG-ATG-ATG-ATG-ATG-ATG-AGA-AGA-3')
- pUC19-FliC vector と6×Hisオリゴをライゲーション.
pLux FliC His-tagの作成
- His-tagを入れたFliCをpLuxの下に置き、LuxRが発現されている条件のもとならば、Quorum SensingでFliCを発現させることができるようにする。
- Quorum Sensingのための遺伝子回路がcolEI oriのvectorに乗っているために、p15Aのベクターを使いdouble transformation することでQuorum Sensingと合わせることができるようになる。
- pLuxをもつベクター側とFliCをPCRを使って、Ligationさせることで作る。
FliC His-tagのbiobrick化
必要なこと
- puc19 vectorの乗っているのでbiobrickのベクターに乗せる。
- 制限酵素サイト(EcoRI,SpeI,PstI)をつぶす。
- FliC His-TagにはEcoRI,SpeI,PstIが含まれているために、そのままではvectorに入れられない。
#片側をblunt end もう一方をApaIの制限酵素サイトをつけ、PCRする。 #vector側も同様にPCRしLigationさせる。
Experiments
Phenotype Check: SDS-PAGE,Western-Blotting
- pUC19-FliC-267His,pET-49bをKeio⊿FliC株にトランスフォーメーション.
- pick colony→preculture 2mL M9 Medium.
- add IPTG 2mL
Display Check: Swarming test
Display Check: Beads Adsorption
- pUC19-FliC-His(Keio⊿FliC株),no-plasmid(Keio⊿FliC株)
Co2+,Ni2+有り・無しでビーズ吸着→吸着しない
- pUC19-FliC-His(Keio⊿FliC株・⊿motB),no-plasmid(Keio⊿FliC株・⊿motB)
co2+,Ni2+有り無しでビーズ吸着→吸着した
- Beads adsorption Protocol