Chiba/Engeneering Flagella

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大腸菌同士を吸着させるため，我々は（細胞の外側に突出しているもののうち）鞭毛に着目した． （図：イメージ）

About flagella

大腸菌は5~10?本/細胞（＜chemotaxisの本で要確認）の鞭毛を持つ．鞭毛を回転/逆回転させることにより環境の良い場所へとtaxisする．鞭毛は長さ約10~15μm，半径約23nmの空孔のチューブ状である．（図：菌全体）

鞭毛のフィラメント部はFliCという蛋白質が規則正しく配列した多量体である．（図：鞭毛アップ）

FliCはD0,D1,D2,D3ドメインを持つ．(種類によってはD1,D2,D3の３つのドメインを持つ)D1とD2はformation of the functional flagellar formation(ffff)の為に必要であるが，D3ドメインは必要でなく可変である（図：蛋白質構造＆鞭毛断面図）

(Ref)


"Variable" FliC D3 domain

可変なD3ドメインに他の＜__aaまでの＞アミノ酸を挿入しても鞭毛が合成される[2]. 詳細も書く．

References

  1. Kuwajima, G. et al.: Nature Biotechnology, 6, 1080-1083 (1988).
  2. Tanskanen, J. et. al.: Appl. and Env. Microbiol., 4152-4156 (2000)

Parts Assembly

FliC-hisの作成

  • pUC19 vectorにFliCをコードする遺伝子を挿入→pUC19-FliC
  • FliCの可変領域のうち、フィラメントの外側部分から５か所を選び、プライマーを設計(207,228,240,252,267)し、エキサイトPCR→pUC19-FliC vector
  • EcoRⅠSite,2×Ser,6×His,2×Ser,NcoⅠ siteをコードするオリゴをデザイン。

(six histidine loop peptide ("His-loop")(containing imidazole side chain), -Ser-Ser-His-His-His-His-His-His-Ser-Ser,encoded by the oligo 5'-TCT-TCT-CAT-CAT-CAT-CAT-CAT-CAT-TCC-TCC-3' and anti oligo 5'-GGA-GGA-ATG-ATG-ATG-ATG-ATG-ATG-AGA-AGA-3')

  • pUC19-FliC vector と6×Hisオリゴをライゲーション.

pLux FliC His-tagの作成

  • His-tagを入れたFliCをpLuxの下に置き、LuxRが発現されている条件のもとならば、Quorum SensingでFliCを発現させることができるようにする。
  • Quorum Sensingのための遺伝子回路がcolEI oriのvectorに乗っているために、p15Aのベクターを使いdouble transformation することでQuorum Sensingと合わせることができるようになる。
  • pLuxをもつベクター側とFliCをPCRを使って、Ligationさせることで作る。


FliC His-tagのbiobrick化

必要なこと

  • puc19 vectorの乗っているのでbiobrickのベクターに乗せる。
  • 制限酵素サイト(EcoRI,SpeI,PstI)をつぶす。
  • FliC His-TagにはEcoRI,SpeI,PstIが含まれているために、そのままではvectorに入れられない。 
#片側をblunt end もう一方をApaIの制限酵素サイトをつけ、PCRする。
#vector側も同様にPCRしLigationさせる。


Experiments

Phenotype Check: SDS-PAGE,Western-Blotting

  1. pUC19-FliC-267His,pET-49bをKeio⊿FliC株にトランスフォーメーション.
  2. pick colony→preculture 2mL M9 Medium.
  3. add IPTG 2mL

Display Check: Swarming test

Display Check: Beads Adsorption

  • pUC19-FliC-His(Keio⊿FliC株),no-plasmid(Keio⊿FliC株)

Co2+,Ni2+有り・無しでビーズ吸着→吸着しない

  • pUC19-FliC-His(Keio⊿FliC株・⊿motB),no-plasmid(Keio⊿FliC株・⊿motB)

co2+,Ni2+有り無しでビーズ吸着→吸着した

  • Beads adsorption Protocol
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