Chiba/Engeneering Flagella
From 2007.igem.org
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Our Aim
大腸菌同士を吸着させるため，我々は（細胞の外側に突出しているもののうち）鞭毛に着目した． （図：イメージ）
About flagella
大腸菌は5~10?本/細胞（＜chemotaxisの本で要確認）の鞭毛を持つ．鞭毛を回転/逆回転させることにより環境の良い場所へとtaxisする．鞭毛は長さ約10~15μm，半径約23nmの空孔のチューブ状である．（図：菌全体）
鞭毛のフィラメント部はFliCという蛋白質が規則正しく配列した多量体である．（図：鞭毛アップ）
FliCはD0,D1,D2,D3ドメインを持つ．(種類によってはD1,D2,D3の３つのドメインを持つ)D1とD2はformation of the functional flagellar formation(ffff)の為に必要であるが，D3ドメインは必要でなく可変である（図：蛋白質構造＆鞭毛断面図）
(Ref)
"Variable" FliC D3 domain
可変なD3ドメインに他の＜__aaまでの＞アミノ酸を挿入しても鞭毛が合成される[2]. 詳細も書く．
References
- Kuwajima, G. et al.: Nature Biotechnology, 6, 1080-1083 (1988).
- Tanskanen, J. et. al.: Appl. and Env. Microbiol., 4152-4156 (2000)
Parts Assembly
FliC-hisの作成
- FliC遺伝子のD3領域に、Histidineループをコードする遺伝子を挿入し、ヒスチジンタグとして発現させる。
→Linker Ligation
- 完成プラスミド
fig1
- Phenotypeをチェック→SDS-PAGE,Western-Blotting
- ヒスチジンタグがFliC遺伝子の外側に発現していることを確認する。
→Beads adsorption
FliC-His generator
- His-tagを入れたFliCをpLuxの下に置き、LuxRが発現されている条件のもとならば、Quorum SensingでFliCを発現させることができるようにする。
- Quorum Sensingのための遺伝子回路がcolEI oriのvectorに乗っているために、p15Aのベクターを使いdouble transformation することでQuorum Sensingと合わせることができるようになる。
- pLuxをもつベクター側とFliCをPCRを使って、Ligationさせることで作る。
FliC-his biobrick
必要なこと
- puc19 vectorの乗っているのでbiobrickのベクターに乗せる。
- 制限酵素サイト(EcoRI,SpeI,PstI)をつぶす。
- FliC His-TagにはEcoRI,SpeI,PstIが含まれているために、そのままではvectorに入れられない。
#片側をblunt end もう一方をApaIの制限酵素サイトをつけ、PCRする。 #vector側も同様にPCRしLigationさせる。
Experiments
Phenotype Check: SDS-PAGE,Western-Blotting
- SDS-PAGE,Western-Blotting
約70kDaにバンドが出ている→FliCが発現していることが確認された
SDS-PAGEを転写。70kDaに抗体抗原反応による茶色いバンドが出た→Histidineの発現が確認された。
Display Check1: Swarming test
Display Check2: Beads Adsorption
- pUC19-FliC-His(Keio⊿FliC株),no-plasmid(Keio⊿FliC株)
Co2+,Ni2+有り・無しでビーズ吸着→吸着しない
- pUC19-FliC-His(Keio⊿FliC株・⊿motB),no-plasmid(Keio⊿FliC株・⊿motB)
co2+,Ni2+有り無しでビーズ吸着→吸着した
- Beads adsorption Protocol
