From 2007.igem.org

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Our Aim

1. Not only express FliC His-tag constant constantly, apply Quorum Sensing as positive feedback genetic switch.
2. Express aiiA(autoinducer inactivate enzyme A) as AHL quencher to generate AHL concentration gradient.
3. To make clear the AHL positive feedback, build genetic circuit expressing aiiA negatively on AHL concentration.
4. Improve the performance of Quorum Sensing.

1.FliC His-tagをただ発現させるだけではなく、Quorum Sensingをpositive feedbackのスイッチとして利用する。
2.aiiAをAHL quencherとして利用し、AHLの濃度勾配をつくりだすAsseyにする。
3.inverterでaiiAのthresholdをはっきり出すような遺伝子回路の設計
4.Quorum SensingのSensing能力の向上

About Quorum Sensing

Sender

AHL Sender express LuxI constantly. LuxI synthesize signaling molecule acyl-homoserine lactone(AHL). AHL go through cell mambrane and diffuse into media.

SenderはLuxIを発現する。SenderはAHLを合成する。細胞膜を通り抜け細胞外にAHLは拡散していく。

Receiver

AHL Receiver express LuxR constantly. AHL come through cell membran. AHL and LuxR bind together and activate Lux promoter.

ReciverはLuxRを発現しLux promoterを含む遺伝子回路を持つ。細胞膜を通り抜けてきたAHLはLuxRと結合して、Lux promoterを活性化する。 

上の回路では

1.Sender内でLuxIが発現しAHLが合成される。
2.Senderの細胞膜を通り抜けたAHLはReceiverの細胞の中に取り込まれる。
3.Receiverに取り込まれたAHLはReceiver内で発現されるLuxRと結合しlux promoterを活性化する。
4.lux promoter下にあるGFPが発現する。

Parts Assembly

AHL Positive Feedback aiiA Receiver

AHL Negative Feedback aiiA Receiver

Experiments

AHL生産能力 Assay

Purpose

• pLuxをアクティブにするために必要なSenderの絶対数
• 株によるAHL生産能力の違い
• AHLのprecursurであるMethionineの有無によるAHL生産量の違い

Result

To Make an AHL Concentration Gradient

• aiiA (autoinducer inactivation enzyme A): degradate AHLs．
• aiiAを発現させ、AHLが広がりすぎないようにする

AHL Positive Feedback aiiA Receiver

• pluxの下にaiiAをおき、Marimo全体がAHL　quencherとして働くようにする。Marimoの内側でAHLを分解し、Marimoの外側のAHL濃度が上がらないようにする。
• 普通のReceiverとともに混ぜて培養すればちょうどいい割合が見つかるかもしれない。

Result

• BBa_T9002との比較ではGFPははじめ発現しないが、しばらくするとGFPが発現するようになる。
• 発現し始めた時が、AHLの濃度がaiiAの分解能力を超えた時だと考えられる。

AHL Negative Feedback aiiA Receiver

• aiiAをpluxとinverterの下に置き、AHLが低い濃度ではaiiAを発現させAHLを分解させ、高い濃度ではaiiAが発現しないような回路を作る。
  • thresholdの境がもっとはっきりするようになるだろう。

Improving Sender & Receiver

Super Sender

• SenderがもっとAHLを合成するようにする。
  • AHL合成経路でS-adenosyl Methionineのをさらに合成させることでAHLの量を増やす。

metKを発現するSenderの回路を作る。

Result

あまり変化がないようである。普通のSenderと変わらない。

・原因
1.合成されたS-adenosyl Methionineがほかの代謝経路に使われて、AHL合成に使われなかったから。
2.Genom PCRでMetKを作ったので、mutationが中に入ってしまったから

Super Receiver

• Receiverをもっと高感度にする。
  • 論文で読んだmutant LuxRを作成し、AHLの濃度が低くてもpLuxを活性化する。

(Collins, C. H., Arnold, F. H. & Leadbetter, J. R. Directed evolution of Vibrio fischeri LuxR for increased sensitivity to a broad spectrum of acyl-homoserine lactones. Mol. Microbiol. 55, 712–723 (2005).)

LuxRのアミノ酸　Ile45->Phe, Ser116->Ala　この変異を入れ、Sensitiveなレシーバーを作る

Method

Site direct mutagenesisでBBa_T9002に変異を入れる変異を入れる。 　LuxRに含まれるNcoI,GFPに含まれるHindⅢを利用した方法をとる。

Result

・Ile45->Phe,Ser116->Alaの2か所の変異を入れたものは常にGFPを発現し続けるために、Swichingができなくなってしまった。
・Ile45->Pheの１か所だけの変異を入れたものを再度作ることにした
 ・一か所変異を入れたものはwild typeのLuxRを発現するものよりも10倍ほど感度が上がった。