From 2007.igem.org

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Our Aim

大腸菌同士を吸着させるため，我々は（細胞の外側に突出しているもののうち）鞭毛に着目した． In making E.coli sticks together, we focused on flagella that are located outside of cells.（図：イメージ）

About flagella

大腸菌は5~10?本/細胞（確認しました）の鞭毛を持つ．鞭毛を回転/逆回転させることにより環境の良い場所へとtaxisする．鞭毛は長さ約10~15μm，半径約23nmの空孔のチューブ状である．（図：菌全体）

鞭毛のフィラメント部はFliCという蛋白質が規則正しく配列した多量体である．（図：鞭毛アップ）

FliCはD0,D1,D2,D3ドメインを持つ．(種類によってはD1,D2,D3の３つのドメインを持つ)D1とD2はformation of the functional flagellar formation(ffff)の為に必要であるが，D3ドメインは必要でなく可変である（図：蛋白質構造＆鞭毛断面図）

• E.Coli has 5-10 flagella randomly distributed around the cell.Most of the time their flagella rotate in one direction(counterclockwise) and the cell swims in a rather straight line.Intermittently, the flagella rotate in opposite direction or pause, as a result the cell turns or tumbles(depending to the number of flagella that do so)Bacterial flagella consist of three parts:a basal body, a hook, and a filament.The filament of E.Coli is a highly rigid, helical, and cylindrical structure 10-15 μm long,23 nm diameter.It is built from ~20000 subunits of a ~55kDa single protein, flagellin.In the case of E.Coli, there is only one flagellin, FliC.

(Ref)

"Variable" FliC D3 domain

可変なD3ドメインに他の＜__aaまでの＞アミノ酸を挿入しても鞭毛が合成される[2]. 詳細も書く．

References

1. Kuwajima, G. et al.: Nature Biotechnology, 6, 1080-1083 (1988).
2. Tanskanen, J. et. al.: Appl. and Env. Microbiol., 4152-4156 (2000)

Parts Assembly

FliC-hisの作成

• FliC遺伝子のD3領域に、Histidineループをコードする遺伝子を挿入し、ヒスチジンタグとして発現させる。

→Linker Ligation

• 完成プラスミド

• Phenotypeをチェック→SDS-PAGE,Western-Blotting
• ヒスチジンタグがFliC遺伝子の外側に発現していることを確認する。

→Beads adsorption

FliC-His generator

• His-tagを入れたFliCをpLuxの下に置き、LuxRが発現されている条件のもとならば、Quorum SensingでFliCを発現させることができるようにする。
• Quorum Sensingのための遺伝子回路がcolEI oriのvectorに乗っているために、p15Aのベクターを使いdouble transformation することでQuorum Sensingと合わせることができるようになる。
• pLuxをもつベクター側とFliCをPCRを使って、Ligationさせることで作る。

FliC-his biobrick

必要なこと

• puc19 vectorの乗っているのでbiobrickのベクターに乗せる。
• 制限酵素サイト(EcoRI,SpeI,PstI)をつぶす。

• FliC His-TagにはEcoRI,SpeI,PstIが含まれているために、そのままではvectorに入れられない。

#片側をblunt end もう一方をApaIの制限酵素サイトをつけ、PCRする。
#vector側も同様にPCRしLigationさせる。

Experiments

Display Check: Beads Adsorption

Purpose

FliC-hisが発現され，鞭毛を形成してるか（"鞭毛にFliC-hisがディスプレイされてるか"？）を確認する．

Method

ビーズ吸着の説明． ヒスチジンはCo（またはNi）と錯体結合?をする．表面に金属イオン（本実験ではCo2+およびNi2+）を配置したビーズを使用して，FliC-hisがディスプレイされた大腸菌とそうでないものを調べた．

ビーズには4つのカルボキシル基のついた炭素鎖がついていて、二価の金属イオンの6つの配位部位のうち、4つと配位結合している。さらに残りの二つの配位部位に、Histidineのイミダゾール基が配位する。このため、Histidine Tagが鞭毛にDisplayされている大腸菌と、ビーズ溶液を懸濁させれば、鞭毛上のHistidineと金属イオンとを媒体として、鞭毛がBeadsに吸着する。この懸濁溶液にMagnetを近づけることにより、BeadsはMagnetに引き寄せられ、Beadsを含まない溶液を上澄みとして分離できる。さらにこのBeadsにImidazoleを含むバッファーを加えれば、このImidazoleがHistidineのImidazole基と競合し、金属イオンにHistidineよりも強い力で配位するため、鞭毛がBeadsからはずれる。ここで再びMagnetを近づければ、大腸菌のついていないBeadsと、大腸菌がいる上澄み溶液とに分離される。この上澄み溶液をプレートにinculateし、コロニーをチェックする。コロニーが形成されれば、鞭毛にHistidine TagがDisplayされているということがわかる。

（＜不十分＆不正確です．直してください）

Samples

• GI826(⊿FliC⊿MotB株)
  • pUC19-FliC-His
  • plasmidなし
• GI826(⊿FliC⊿MotB株)
  • pUC19-FliC-his
  • plasmidなし

Procedure

• pUC19-FliC-His,をJW1908(Keio⊿FliC株)にトランスフォーメーション。培養液をビーズと懸濁させ、大腸菌をBeadsに吸着する。

吸着した大腸菌をbufferで溶出し、inculateする。(Negative Control 1:Noplasmid,Negative Control 2:Co2+あるいはNi2+の有り・無し) →吸着していなかった

• pUC19-FliC-His,をGI826(⊿FliC⊿MotB株)にトランスフォーメーション。培養液をビーズと懸濁させ、大腸菌をBeadsに吸着する。

吸着した大腸菌をbufferで溶出し、inculateする。(Negative Control 1:Noplasmid,Negative Control 2:Co2+あるいはNi2+の有り・無し) →吸着していた。

Results

Plasmidあり、かつCo2+つきビーズ、のコロニー数は、その他のものよりはるかに多い。30倍以上。 Histidine Tagの存在によって大腸菌がビーズに吸着吸着していることがわかる。 The number of colony dramatically decreased with out Co2+ or FliC-His plasmid.