Freiburg07/labnotes
From 2007.igem.org
There are days left until the Jamboree!
Fri, 3rd August 2007
workers: Natalia, Moritz
assessment of the 9 colony o/n cultures with 2,4,6 aa linker calmodulin
Sat, 4th August 2007
Philipp (12-14Uhr):
-Evaluation of the overnight-background-tests with the beta-lactamase/calmodulin-constructs in e.coli
-Centrifugation and labeling of the o/n cultures (of e.coli) containing various iGEM-parts
Mon, 6th August 2007
11 bis 14 Uhr
Anwesend: Corinna, Dario, Kristian, Moritz, Natalia, Philipp
Besprechung der Ergebnisse der letzten Woche
Schnittstellenplanung für spezifische iGEM-Schnittstellen:
- ca. 20% geschafft
blac1-calmodulin-blac2:
- Test für Hintergrund bis zu Amplcilin-Konzentrationen von 200 µl/ml; alle positiv!
PCB-Planung:
- Anfragen für feritges Plasmind per E-Mail; Warten auf Antwort
- Planung für Klonierung aus iGEM-Kit steht, falls wir das Plasmid selbst zusammenbasteln müssen
dhfr1-winzip-dhfr2a:
- Die letzte Sequenzierung zeigte Felher im Konstrukt. Für eine neue Sequenzierung wurden eine anderer Klon gepicked. Die DNA für die nächste Sequenzierung wurde bereits geprept.
Planung Fhy1 und PhyA:
- mögliche Kombinationen wären: dhfr1-Fhy1; PhyA-dhfr2; blac1- Fhy1; PhyA-blac2; Kombinationen mit YFP/CFP werden vielleicht von Urs zusammenkloniert
Planung der Arbeit für die laufende Woche ( 6.8. bis 10.8.2007 )
1. Testverdau und Sequenzierung des Plasmids pFR320dp-blac1-winzip-blac2 (Philipp)
2. Testverdau und Sequenzierung des Plasmids pFR320dp-blac1-calm-blac2 mit 3 verschiedenen Linkerlängen (Natalia, Dario)
3. Primer von PhyA und Fhy1 für PCR planen (Moritz)
4. PCB-Enzyme aus iGEM-Kit zusammenklonieren (Moritz)
5. Reinigung der Konstrukte:
Ansetzten der Übernachtkultur und einer Expressionskultur (Corinna)
Messung der OD und Zellernte (Philipp, Dario)
Dialyse (Philipp, Max)
6. Digitalisierung der Laborjournals (Corinna, Natalia)
7. Hintergrundtest für ein Konstrukt - 4GlyLinker- wiederholen (auf Platten) bei Konzentrationen von 50, 100, 200 und 400 µg/ml Ampicilin (Max)
8. Testverdau und Sequenzierung des Plasmids blac1-winzip-dhfr2 (Dario, Natalia)
Zeitplan der laufenden Woche
Moritz: 9 bis 14 Uhr
Dario: 9 bis 17 Uhr(Mo, Mi, Fr)
Philipp: 17 bis 18 Uhr
Corinna: 18 bis 19 Uhr
Natalia: 9 bis 14 Uhr
Max: ???
Philipp:
Planung und Ansatz des erneuten Testverdaus von dFR320dp-blac1-winzip-blac2, diesmal mit BssSI
Corinna
19.00 Uhr: Verdau-Ansatz von pFR320dp-blac1-winzip-blac2 aus 37 °C-Raum gegholt und Testgel bei 100 V laufen gelassen
20.15 Uhr: Photo von Gel aufgenommen; Auswertung: nur 1 Bande zwischen 2500 und 3000 bp zu erkennen; die eigentlich erwarteten kleineren Banden sind weder auf dem Photo noch im Gel zu erkennen. Evtl. war die eingesetzte DNA-Kontentration zu gering, die große Bande war auch nur relativ schwach zu sehen.
21.00 Uhr: Protokoll des Treffens digitalisiert
Tu, 7th August 2007
10 to 15 o´clock
Moritz: Strategy for cloning iGEM parts for PCB biosynthesis.
Digest of the following iGEM Parts:
B0034 with SpeI and PstI (Vektor)
I15008 with XbaI and PstI (Insert1)
I15009 with XbaI and PstI (Insert2)
Digest from 14 o´clock into the 37 degree room!
10 bis 15 Uhr
Natalia:
Plasmidkarten erstellt:
1. pFR320p_b1_2calmo2_b2
2. pFR320p_b1_4calmo4_b2
3. pFR320p_b1_6calmo6_b2
alle Plasmidkarten sind im neuen Ordner bla_calm_bla
Testverdau geplant.
18.30 Uhr
Corinna:
Verdau aus 37 °C-Raum geholt und eingeforen bei -20 °C
We, 8th August 2007
Moritz (9 - 15.30 o´clock):
- Planning of the PCR for PhyA und FHY1
- Prep. Gel for iGEM part digests: Vector and Insert1 respectively Insert2 were cutted out
- Gel-extraction of Vector, Insert1 and Insert2
- Determination of the DNA concentration (DNA Prep)
- Ligation (2 approaches): Vektor(pSB1A2/B0034) + Insert1(I15008) respectively Insert2(I15009)
Max (12 - 16.20 Uhr):
- Amplifikation von b1-calmo-b2 Glycerin-stock Zellen
- Vorbereiten von Agar-Platten mit unterschiedlichen AMP Konzentrationenbr( Hintergrundtest)
- Ausstreichen der amplifizierten b1-calmo-b2 zellen auf je 3 Amp-Platten (37°C Raum über Nacht)
Natalia (9-14 Uhr
- Planung und Ansetzen des Testverdaus für pFR320p_b1_#calmo#_b2
- Planung und Ansetzen von Testverdau für Plasmid dFR320_b1_winzip_dhfr2a
Dario (14-18):
- Planung und Ansetzen von Testverdau für Plasmid dFR320_b1_winzip_dhfr2a
- Gellauf des Testverdaus von Plasmid pFR320_b1_#calmo#_b2
- Auswertung des Testgels
Corinna (15-16 Uhr):
- Ansatz einer über-Nacht-Kultur von Zellen mit pFR320dp-blac1-clamo-blac2 (Linkerlänge 4AS) bei 28 °C
Thu, 9th August 2007
Gruppenbespechung (12 - 14 Uhr)
Anwesend: Natalia, Corinna, Dario, Moritz, Max, Philipp
Allgemeine Sachen:
- Eppis besser beschriften (Datum, Plasmid/Zellen, wurde Testverdau/Sequenzierung gemacht, bei Fragmenten Enzyme angeben
- Liste von Inhalt der Boxen erstellen (Dario)
- Anlegen einer neue Box nur für Plasmide
Ergebnisse seit dem letzten Treffen und weitere Planung:
1. Testverdau und Sequenzierung pFR320dp-blac1-winzip-blac2:
- unklares Ergebnis; Testverdau wiederholen: aus Glycerinstock eine Über-Nacht-Kultur ansetzten - Miniprep - Verdau (Philipp, Natalia)
2. Testverdau und Sequenzierung pFR320dp-blac1-calmo-blac2:
- unklares Ergebnis; Testverdau mit mehr DNA und mehr Enzym wiederholen, Gel nicht zu lange laufen lassen
3. Primer für PhyA und Fhy1: läuft (Moritz)
4. PCB: läuft (Moritz)
5. Reinigung des Konstrukts blac1-4-calmo-4-blac2:
- kaum Wachstum in der Über-Nacht-Kultur; angeimpfte Expressionskultur wächst ebenfalls sehr langsam
mögliche Erklärungen: falsches Plasmid, falsche CAM-Konzentration, Temperaturabhängigkeit (28 °C!) der Plasmidkopien, XL-1 blue, toxisches Produkt; Zellen wachsen anscheinend sehr langsam
Sonntag: von allen 3 Konstrukten Über-Nacht-Kulturen von Klon 1 ansetzen (Corinna)
6. Digitalisierung: läuft (Natalia, Corinna)
7. Hintergrund-Test (AMP):
- Wachstum bei allen Konstrukten und allen getesteten Konzentrationen, konstitutive Aktivität?
8. Testverdau und Sequenzierung pFR320dp-blac1-winzip-dhfr2: Gel wird gerade ausgewertet (Dario)
neues Projekt:
- kleines Lactamase-Fragment aus dem Plasmid entfernen (Umklonierung)
Moritz (9.30 - 15 o´clock):
- Transformation of the Ligation into RV 308 (chem. competent):
the Ligations of Vector + Insert1 (pSB1A2/B0034 + I15008),
as well as Vector + Insert2 (pSB1A2/B0034 + I15009)were transformed.
- talk with Kristian concerning the Primers for FHY1 and PhyA:
Corinna (8.00 - 9.30 Uhr):
- In der über-Nacht-Kultur war in einem Ansatz nur eine sehr geringe Trübung als Zeichen für Wachstum zu erkennen, im anderen Ansatz war das Medium sogar noch klar.
- Trotzdem: Ansatz der Expressionskultur für die anschleißende Reinigung des Konstrukts blac1-4calmo4-blac2
Dario (8.30 - 16 Uhr):
- Gel laufen lassen von Testverdau für Plasmid dFR320_b1_winzip_dhfr2a mit KpnI und AflIII, Auswertung zeigte
die von uns geplannte Banden
- Gellauf des Testverdaus von Plasmid pFR320_b1_#calmo#_b2 ausgewertet und die von uns geplanten Banden
waren nicht zu erkennen, mögliche Fehlern: Gel zu lang laufen lassen oder Volumen an Plasmid
- Wiederholung von Testverdaus von Plasmid pFR320_b1_#calmo#_b2 mit SpeI und KpnI. Noch nicht ausgewertet
- Messung von Optische Dichte (OD) von Expressionskultur pFR320p_blac1_4calmo4_blac2 (von Corinna):
OD Werte waren sehr niedrig und ist gar nicht gewachsen. Muss wiederholt werden. Wird wahrscheinlich
mit pFR320p_blac1_2calmo2_blac2 wiederholt
Max (12 - 16Uhr):
- Auszählen der verschieden konzentrierten AMP platten mit b1-calmo-b2 konstrukten ergab, dass alle platten
übertrieben bewachsen wahren und keine Aussage über die Funktionalität der unterschiedlichen Konstrukte
getroffen werden konnte. Grund dafür ist wohl fehlerhaftes Ampicilin , dass für die Platten verwendet wurde!
- Ansetzen von 20 1ml Aliquots Ampicilin (100 mg/ml) für neue platten und verdünnungstestreihe der konstrukte
Philipp (12-16Uhr):
- Ansatz der ÜNK von Klon B1 (Glycerinstock) zur Auffrischung des Bestandes an pFR320dp-blac1-winzip-blac2
-Verschiedene kleinere Arbeiten (Etikettieren, Boxen, Auswertung...)
Fr, 10th August 2007
Moritz (9 - 14 o´clock):
- preperation of an overnight culture from Transformation - Plates:
The colonies grow to an high density! The plates could contain the wrong antibiotic (unfortunately I recognized it too late) that is why the Colis (RV 308) could have lost the plasmid!!
- Primer design (PhyA u. FHY1) is nearly completed.
Max (13.30 - 16.30 ):
- Aufzucht von b1-calmo-b2 zellen mit 2,4 und 6 Glycinen linker aus den Glycerin stocks für 1 Stunde
- Giessen neuer Platten mit je 25µg CM und 50µg, 100µg, 200µg sowie 400µg Amp, für eine neue Verdünnungs-testreihe
- Ausplattieren der angereicherten b1-calmo-b2 Zellen auf den Platten; Bebrütung bei 37°C über Nacht
Natalia (9-14Uhr)
- Plasmid dFR320d_b1_wz_dhfr2 zum Sequenzieren abgegeben
- ÜNK geprept und die Konzentration bestimmt
- Bestimmung der Konzentration von der Expressionskultur
Corinna (15.00 - 17.00 Uhr):
- Kulturen (von Moritz) aus 37 °C-Raum geholt. In allen 6 RGs sind die Zellen gewachsen.
- Anlegen von Glycerin-Stocks
- Miniprep von allen Proben
Sa, 11th August 2007
Max (12.30 - 14.00 uhr):
- Auszählen der Platten mit den unterschiedlichen Amp Konzentrationen; Dabei war ein Trend der Zellen mit 2- und 6 Glycinen Linker zu erkennen, bei höheren Amp konzentrationen schlechter zu wachsen! Die Zellen mit 4 Glycinen als Linker zeigten überhaupt kein wachstum auf 50, 200 und 400 µg Amp wobei auf 100 µg nur 4 veeinzelte klone zu sehen waren. Mit Klon 1 b1- 4calmo4 -b2 sollte eine weitere Verdünnungsreihe unter Zugabe verschiedener Calciumtiter durchgeführt werden!
Su, 12th August 2007
Corinna: (13.00 -14.15 Uhr)
- Ansatz von Ü/N-Kulturen aus Glycerinstocks von Zellen mit allen 3 Linkerlängen (immer Klon 1 verwendet)bei 28 °C; es soll das Wachstum beobachtet werden, da bei der letzten Ü/N-Kultur (Linkerlänge 4 AS)nach über 16 h kaum Zellen gewachsen sind.
Mo, 13th August 2007
Besprechung (12.00 bis 14.00 Uhr)
Folgende Probleme wurden festgestellt:
1. Testverdau der blac1-calmo-blac2 Konstrukte zeigt nur religierten Vektor
- neue Ligation von pFR320dp-blac1-winzip-blac2 und Calmodulin aus PCR (KpnI und SpeI)
- anschließende Transformation
- je 6 Klone von der Platte picken, davon je 3 prepen
- Testverdau von insgesamt 9 Klonen
- Kontrolle der bisherigen Arbeitz für dieses Konstrukt:
05.7.07 - Testverdau von pFR320dp-blac1-winzip-blac2
20.7.07 - Sequenzierung
26.7.07 - PCR für Calmodulin; Verdau des Vektors mit KpnI und SpeI
27.7.07 - Reinigung Calmodulin
31.7.07 - Testverdau pFR320dp-blac1-winzip-blac2, B.2 Klon zeigte richtige Sequenz; Ligation
01.8.07 - Transformation in RV308 und XL-1
02.8.07 - Auswertung der Transformation; Picken und ansetzen von über-Nacht-Kultur
03.8.07 - Spinprep
2. Klone wachsen im Flüssigmedium, aber nicht auf Platten
Weitere Schritte:
- Verdau des Vektors pFR320dp-blac1-w-blac2
- PCR dhfr1 für pFR320-blac1-winzip dhfr2
Moritz (9-14.30 o`clock):
- Preparative digest from Vector1 (Plasmid with PBAD) and Insert1 (Plasmid with RBS + HO1)
- Preparative digest from Vector2 (Plasmit with Terminator) and Insert2 (Plasmit with RBS + PcyA)
Enzymes : Vector1 with SpeI, PstI. Insert I with PstI, XbaI. Vektor2 with EcoRI, XbaI. Insert2 with EcoRI, SpeI.
Natalia (11.00 - 11.30)
- Ansetzen neuer Expressionskultur
Max (12.30 - 16.30 uhr):
- Präperativer Verdau des pFR 320p b1- wz -b2 Vektors mit SpeI und KpnI
- Planung und Ansetzen einer PCR für dass Dhfr1 - Fragment aus dem ausgangsvektor Nr. 183
- sich aufgeregt
Di, 14th August 2007
Moritz (10-13 o´clock)
- Prep. Gel: interpretation forced me to start the cloning of the iGEM parts a few steps behind!!!
- Ligation(2 approaches): Vector(pSB1A2/B0034) + Insert1(I15008) alternatively Insert2(I15009)
Max (12 - 16 Uhr):
- Laufen des Präperativen Gels mit dem Dhfr- Fragment 1 sowie dem präperativen Verdau von Vektor
pFR 320p b1- wz -b2
- Die Auswertung des Gels war positiv und es konnten die gewünschten Banden eluiert werden
- Der Vektor pFR 320p b1- wz -b2 wird vor der Ligation mit den Calmodulin Konstrukten Dephosphoryliert (Natalia)
- wieder aufgeregt
Natalia (11:00 -12:00; 14:30 - 18:00)
- OD der Expressionskultur gemessen
- Dephosphorylierung des Vektors: pFR320p_b1_wz_b2
- Ligation der Calmodulinkonstrukte
- Präparativer Verdau von dhfr1
We, 15th August 2007
Moritz (9.30- 17.30 o´clock):
- Transformation of the ligation (Ligation(2 approaches): Vector(pSB1A2/B0034) + Insert1(I15008) alternatively Insert2(I15009))
- Primer design and deciding what to order by gene-synthesis
Dario (12.00 bis 18 Uhr):
- Reinigung der PCR-Produkte von Dhfr1-Fragment
- Moritz helfen beim Digitalisirung der PhyA und FHY1 Primer Sequenzen
Natalia (9:30 - 12:00)
- Transformation der Ligation vom 14/08/07
- Vektorverdau b1_wz_dhfr2 angesetzt
Th, 16th August 2007
Moritz (9.30 - 15.30 o´clock):
- Overnight culture from the transformation (pSB1A2/B0034/I15008 bzw. pSB1A2/B0034/I15009)
- ordering the Primers
Natalia (9:30 - 15:30)
- Gel laufen lassen mit dem Verdau vom 15/08/07
- Banden ausgeschnitten und anschließend gereinigt
- Auswertung der Trafo-Platten
- Ligation von b1_wz_dhfr2-Vektor + Insert (dhfr1), zusätzlich eine Negativ-Probe
Max (12 - 16 uhr):
- von den b1- #calmo# -b2 transformationsplatten vom 15/08/07 wurden je 3 klone gepickt und Übernachtkulturen mit diesen angesetzt
- Vorbereiten neuer AMP - Verdünnungsplatten mit 50, 100, 200 und 400µg AMP sowie je 25µg CM pro Platte (im 4°C Raum bis zur verwendung aufbewahrt!)
Fr, 17th August 2007
Moritz (9.30 to 12 o´clock):
- Spin Prep of the overnight culture and create Glycerin stocks
Natalia (10 - 12.30 Uhr):
- Transformation von Plasmid mit dhfr1-winzip-dhfr2br
Max Vormittag (10 - 13.45 uhr):
- Von den Übernachtkulturen vom 16/08/07 der unterschiedlichen Calmodulin - Konstrukte ( 2, 4 und 6 Glycine linker) wurde jeweils ein Glycerinstock angelegt
- Klon Nr 3 jedes Konstruktes ( 2, 4 und 6 Glycine linker) wurde nur runterzentrifugiert und dass pellet so eingefroren
- Klon Nr 2 und Nr 1 wurden mit QIAGEN Plasmid mimiprep-kit bearbeitet und so die Plasmid DNA eluiert, mit welcher anschliessend ein Testverdau mit KpnI und SpeI angesetzt wurde
- nicht mal richitg aufgeregt
Nachmittag (16 - 19 uhr):
- Ansetzen von 2 mL Kulturen der Glycerinstocks b1 - calmo - b2 (mit 2, 4 und 6 Glycinen) um diese im Fall eines positiven Testverdaus auszuplattieren
- Gellauf des Testverdaus für 45 Minuten; Im Gel waren ausschliesslich die gewünschten Banden zu erkennen, woraus sich schliessen lässt dass die Ligation diesmal erfolgreich war!
- Ausplattieren von Klon Nr 1 der hochgezogenen Zellen (ca 1 Stunde Wachstum!) auf den AMP - Verdünnungsplatten vom 16/08/07; Bebrütung bei 37° über Nacht (Platten dabei immer auf den Kopf stellen!)
Mo, 20th August 2007
Max (12 - 14 uhr):
- Auszählen der AMP - Verdünnungsplatten vom 17/08/07; Nur der Klon mit 2 Glycinen Linker zeigte auf der Platte mit 50 µg 46 Kolonien, auf der Platte mit 100 µg wuchs eine einzelne kolonie. Alle anderen Platten waren vollkommen unbewachsen, woraus sich schliessen lässt, dass diese Klone nicht in der Lage sind AMP abzubauen!
- Ansetzen einer 50 mL ÜNK des Klons Nr 1 mit 4 Glycinen Linker als Expressionskultur
- Abgabe der Calmodulin Konstrukte mit 2, 4 und 6 Glycinen Linker zum Sequenzieren; Es wurde hierfür immer Klon Nr 1 abgegeben; Auswertung sollte nach Möglichkeit bitte jemand anders machen, da ich ab morgen auf Urlaub bin;)
Natalia, Dario (13 - 16)
- Amplifikation der dhfr1_wz_dhfr2 Klone
- es wurden 6 Große und 6 kleine Klone von der Platte mit der Ligation v. Klon2 gepickt
- Auszählen der Platten (danke Dario)
Gruppenbesprechung: (13.30-14.30)
Anwesend: Natalia, Max, Dario
Plannung der nächsten Tage
1. Von Konstrukt b1_calmo_b2:
-Sequenzierung Auswerten
-Wachstumstest auf Platten mit verschiedene Konzentrationen von Ca2+, IPTG und Amp
0 0,1 1 10 mM Ca2+
0,5 0,5 0,5 0,5 mM IPTG
50 50 50 50 mg/ml Amp
(Platten pro Konstrukte)
- Plannung der Expressionkultur von b1_calmo4,4_b2
- Konstrukte Reinigen
- Reinigung der Periplasmatischeaufschuss
2.DHFR-Konstrukt.
- Klon auf Platten
Vektor Ligation zeigt ca.1/3 Hintergrund bei Klon 2
- Jetz werden 12 Klone gepickt und in Glycerinstocks aufbewahrt
- 6x der Klone werden Spin geprept und 6x Klone eingefroren
- Später alle 6x Testverdaut
- Klonierung der Calmodulin Fragmente werden nach der Testverdau gemacht
(KpnI/SpnI)
Tu, 21th August 2007
Moritz (12-20.30):
- PCR for Phytochrome and FHY1 Inserts
Dario (12-20:30):
- Expressionskultur von b1_calmo_b2 Gly 4 (XL-1)
Natalia (9:30 - 21:00)
- Preppen der gepickten Klone vom 20/08/07
- von allen (12) Klonen wurde ein Glycerinstock angeleget
- Klone 3, 5, 6, 7, 9, 10 wurden runterzentrifugiert und eingefroren
- Klone 1, 2, 4, 8, 11, 12 wurden geprept und testverdaut mit EarI
- Gel laufen lassen mit dem Testveradu
- Präparativen Verdau mit Klon2 angesetzt
- Platten für den Wachstumstest geggossen
- Plasmidkarte für das Plasmid: dFR320d_dhfr1_wz_dhfr2A erstellt
We, 22th August 2007
Moritz (10-20 o´clock):
- Prep. gel, gel-extraction, digest and PCR purification Kit from our PCR products
- Planning for the cloning of PCB biosythesis enzymes
-Ligation of Fhy1 with YFP (N- and C-terminal)
-Overnight culture of DHFR plasmids from laboratory glycerin stocks
Dario (9.30-21.00 Uhr):
- Transformation b1_calmo4,4_b2 Klon 1 in RV308
- Reinigung der Expressionskultur von b1_calmo4,4_b2 Klon 1 in XL-1
- Vorbereitung der Puffers für die periplasmatische Extraktion der Proteine von b1-cal4,4_b2 K1
Natalia (9:00 - 15:00)
- Sequenzierung von dhfr1_wzdhfr2 Klon 1/4
- Präparativer Verdau v.:21/08/07 Bande ausgeschnitten
- Präparativen Verdau mit Klon1/4 angesetzt
- Klon1/2/4 von dhfr1_wz_dhfr2 ÜNK angesetzt
- ÜNK von b1_2,4,6calmo246_b2 angesetzt
- Auswertung der Sequenzierung vom 10/08/07 v. dhfr2
Thu, 23th August 2007
Beschprechung(14:30 bis 16:00 Uhr)
1. Bei pFR320p_b1_2,4,6_b2
- Sequenzen noch nicht Ausgewertet:
wird aber von Dario und Natalia gemacht
- Konstrukte auf Platten bei verschiedene Konzentrationen von Ca2+, IPTG und Amp müssen ausplattiert werden:
wird von Natalia gemacht
- Weiteres muss mit Jochen besprochen werden
- Transformation in BL21 mit pREP4
2. Bei DHFR1_wz_DHFR2
- Sequenziert: Austuach vn ein paar Basen aber außerhalb DHFR. Mögliche Fehler ist nicht von Konstrukt, sondern von der Plasmidkarte
- Verdau mit KpnI/SpnI geführt, War Positiv aber mit zusätzlichen Banden.
Jetzt muss kloniert werden.
3. Protein Reinigung
- 1. Versuch in XL-1
- Aktivitättest fehlt
4. PCR
- Mit Fhy1, Phy A und Fhy hat bis jetzt alles funktionirt (Verdaus und PCR)
- Jetzt muss Fhy1 mit YFP/YFP mit FHY/ PHy A mit CFP fusioniert werden
- Weitere Untersuchungen. Wird ein FRET durchgeführt (Aktivitätstest)
Dario (10.30-21.30 Uhr):
- Transformation b1_calmo4,4_b2 Klon 1 in RV308 wiederholt
- Reinigung der Expressionskultur von b1_calmo4,4_b2 Klon 1 in XL-1 weitergeführt
- Natalia helfen beim ausplattieren von der verschiedenen Calmo-Konstrukte bie verschiedene
Konzentrationen von Ca2+, IPTG und Amp
Natalia (9.30-21.30)
- Auswerten der Plasmidsequenzierungen von dhfr1_wz_dhfr2 Klon4 und Klon1
- Gel laufen lassen mit d. Präparativen Verdau von dhfr1_wz_dhfr2
- Vektorbande v. Klon4 ausgeschnitten, dephosphoryliert und eingefroren
- Messen der OD der UNK von b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 immer wieder verdünnt und anschließend auf Platten mit unterschiedlichen Konzentrationen (Calcium und Amp) ausgestrichen
Moritz (9.30 - 16.30 o´clock):
- Spin Prep of the overnight culture (from plasmids of the laboratory Glycerin stock: 172, 179 and 183)
- digest of the (function as vectors for PhyA and Fhy1 Inserts)
- Transformation of YFP-Fhy1 (small and big), Fhy1-YFP (small and big) plasmids, iGEM Part I0500 on pSB2K3
Fr, 24th August 2007
Moritz (9-17 o´clock):
- Analyses of the transformation: iGEM Part does not grow, Fhy1 (big and small)- YFP does not grow, YFP-FHY1 grows
quite good
- new transformation of the iGEM parts
- Prep.-Gel of the vector digest (172,179,183)
- new ligation of the Fhy1-YFP constructs, as well as PhyA-CFP
Dario (12-16 Uhr):
- Auszählen und Aunswertung der Platten von bl_calmo2,4,6_b2 bei verschidene Konzentrartionen von Ca2+,
Amp und IPTG.
- PheBo loding Puffer für die Proteinreinigung von b1_calmo4_b2 in XL-1 gewechselt.
Natalia (9.00-11.00)
- erneut: Präparatiververdau von dhfr1-wz-dhfr2 Klon4
- dhfr1-wz-dhfr2 Klon1 und 2 wurden geprept und eingefroren
- Auswertung der ausplattierten Klone b1-2,4,6calmo2,4,6-b2
Sa, 25th August 2007
Moritz (11-14o´clock):
- new transformation of YFP-Fhy1 and PhyA-CFP constructs
- new transformation of iGEM- Part I0500, because it does not grow again!!!
- Gel-extraction of vectors (172,179,183)
Mo, 27th August 2007
Moritz (11-17 o´clock):
- Dephosphorylation of vectors (172, 179, 183)
- PCR for Fhy1 Inserts
- Transformation of iGEM Part I0500
- Ligation: Fhy1(big and small)-YFP; YFP-Fhy1(big and small); PhyA-CFP
Natalia, Corinna(9.00 - 16.00)
- gel: präparativer Verdau vom 24/08/07 ausgeschnitten und dephosphoryliert
- Sequenzierungen ausgewertetvon b1-2,4,6calmo2,4,6-b2
Tu, 28th August 2007
Corinna, Natalia (9.30-22.30 Uhr):
- Auswertung der Sequenzierungen für die Lactamase-Calmodulin-Konstrukte (Linkerlänge 2,4,6 AS): viele Fehler im Calmodulin, Veilleicht aber auch nur Fehler in der Sequenzierung
- neue Proben zur Sequenzierung mit neuem Primer ca. 80 bp vorm Calmodulin abgegeben
- neue PCR für Calmodulin mit verschiedenen Linkerlängen; Reinigung der PCR-Produkte
- Verdau der PCR-Produkte mit KpnI und SpeI
- prep. Gel : Template-Banden waren zu erkennen, aber leider keine Produkt
- erneuter Ansatz der PCR; diesmal wurden die Vorverdünnungen von Primern und Template frisch hergestellt
Moritz (11-22.30 o´clock):
- Trafo der Ligation (Fhy1(big bzw. small)-YFP; YFP-Fhy1(big bzw. small); PhyA-CFP)
- Verdau der PCR Produkte, Prep.-Gel
- ÜNK der Trafo von iGEM Part I0500 , allerdings auf konzentrierter Platte nur 6 Kolonien gewachsen
- Ligation: Fhy1(big bzw. small)-dhfr1; dhfr1-Fhy1(big bzw. small); PhyA-dhfr2
Mi, 29th August 2007
Moritz(9.30-21.30 Uhr):
- ÜNK der Trafo (Fhy1(big bzw. small)-YFP; YFP-Fhy1(big bzw. small); PhyA-CFP)
- Trafo der Ligation (Fhy1(big bzw. small)-dhfr1; dhfr1-Fhy1(big bzw. small); PhyA-dhfr2)
- Spin Prep der ÜNK (Fhy1(big bzw. small)-YFP; YFP-Fhy1(big bzw. small); PhyA-CFP)
Natalia, Corinna (9.30-16.00)
- Reinigung der PCR-Produkte
- analytisches Gel laufen lassen
- Verdau der PCR-Produkte und Präparatives Gel
- Ligationsansatz
Do, 30th August 2007
Moritz (10.30-15.30 Uhr):
- Auswertung der Trafo Platten (Fhy1(big bzw. small)-dhfr1; dhfr1-Fhy1(big bzw. small); PhyA-dhfr2)
- ÜNK von Trafo
- Abgabe Sequenzierung (Fhy1(big bzw. small)-YFP; YFP-Fhy1(big bzw. small); PhyA-CFP)
- Erstellung von Plasmidkarten (Fhy1(big bzw. small)-YFP; YFP-Fhy1(big bzw. small); PhyA-CFP)
Corinna, Natalia (9.30-11.30)
- Transformation der Ligation dhfr1-2,4,6calmo2,4,6-dhfr2 ; b1-2,4,6calmo2,4,6-b2
Fr, 31th August 2007
Moritz (10.30 U- 18.15 Uhr):
- Spin Prep der ÜNK (Fhy1(big bzw. small)-dhfr1; dhfr1-Fhy1(big bzw. small); PhyA-dhfr2)
- Auswertung der Sequenzierung (Fhy1(big bzw. small)-YFP; YFP-Fhy1(big bzw. small); PhyA-CFP):
-> leider bin ich mit der Auswertung nicht ganz fertig geworden. die übereinander gelegten Sequenzen befinden sich im Klonierordner.
Corinna, Natalia (10-12)
- Amplifikation gepickter Klone
Sa, 1st Sept.2007
Natalia (14.30-17.30)
- Glycerinstock d. amplifiz. Klone
- Klone 1,2 von dhfr1-2,4,6calmo2,4,6-dhfr2 b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 geprept
- klon 3 von dhfr1-2,4,6calmo2,4,6-dhfr2 b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 runterzentrifugiert und eingefroren
Mo, 3rd Sept. 2007
Natalia (10.30-19.00)
- Plasmidkarten für dhfr1-2,4,6calmo2,4,6-dhfr2 erstellet
- Testverdau: dhfr1-2,4,6calmo2,4,6-dhfr2
- Miniprep: dhfr1-6calmo6-dhfr2 Klon3, b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 Klon3
- Sequenzierungen vom 01.09.07 ausgewertet
- zum Sequenzieren abgegeben: dhfr1-2,4calmo2,4-dhfr2 Klon1,2
Dienstag, 4th Sept. 2007
Natalia (10.30-19.30)
- Testverdau für b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 dhfr1-6calmo6-dhfr2 Klon3 angesetzt, laufen lassen und ausgewertet
- erneute Ligation mit b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 angesetzt
- Präparativer Verdau: b1-wz-b2 angesetzt, da Vektor fast leer ist
- mein Hirn mit Sequenzierungen gequält (Auswertung von dhfr1-2,4calmo2,4-dhfr2 Klon2,1)
- zum Sequenzieren abgegeben: dhfr1-6calmo6-dhfr2 klon3, dhfr1-4calmo4-dhfr2 Klon1
- für Phillipp: yfp big und small amlifiziert: je 5 Klone
Mittwoch, 5th Sept. 2007
Natalia (10.00-15.00)
- Transformation der Ligation von b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 in XL-1
- neue Platten mit Cmp gegossen
- parallel zur Ligation wurden 8 weitere Klone (Trafo vom 31.08.07) von b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 gepickt
- Ptäparatives Gel (b1-wz-b2 - Vektorverdau) auf dem Gel aufgetragen, die Banden ausgeschnitten und gereinigt
Philipp (17.30-21.00)
- Anlegen von Glycerinstocks mit YFP-Fhy1 (5x "big", 5x "small")
- Spinprep mit allen o.g. Kulturen
Do, 6th Sept. 2007
Natalia (10.00-18.30
- Glycerinstock von den amplifizierten Klonen (5.9.7) angelegt, die ersten vier Klone wurden geprept, die anderen vier nur als Pellett eingefroren
- geprepten Klone (1-4) b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 wurden mit Kpn1 und Spe1 verdaut und aufs Gel aufgetragen
- b1-2calmo2-b2 Klon 2 und b1-6calmo6-b2 Klon 4 hatten nach der Größe zu urteilen das richtige Insert und wurden zum Sequenzieren abgegeben
- Trafo vom 05/09/07: von den ligierten Plasmiden wurden je 10 Klone gepickt und amplifiziert (b1-2,4,6calmo2,4,6-b2)
Fr, 7th Sept. 2007
Natalia (10.00-18.00)
- Vektor b1-wz-b2 vom 05/09/07 dephosphoryliert
- Gepickte Klone vom 06/09/07: von allen 30 (b1-2,4,6calmo2,4,6-b2)Klonen wurde ein Glycerinstock angelegt, Klon 1-5 b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 wurde geprept und testverdaut, Klon 6-10 als Pellett eingefroren
- nach dem Testverdau: 3 von fünf Klonen (b1-2,4,6calmo2,4,6-b2) sind positiv
Mo, 10th Sept. 2007
Natalia (10.00-17.00)
- angefallene Sequenzierungen ausgewertet
- Klon 1 von b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 vom 07/09/07 zum Sequenzieren abgegeben
Philipp (13.30-16.30)
- Abgabe der am 05.09.geprepten Plasmide zur Sequenzierung
- Einlesen, Erkundigen...
Di, 11th Sept. 2007
Philipp (11.30-16.00)
- Sequenzierungen vom 10.09. ausgewertet
- weitere Information über den Stand der Dinge
Mi, 12th Sept. 2007
Philipp (12.00-15.30)
- Sequenzierungen vom 30./31.08. ausgewertet,
- maps erstellt
- festgestellt dass PhyA-CFP nicht ligiert ist
(nur Vektor sequenziert)
Do, 13th Sept. 2007
Philipp (13.00-16.30)
-mehr maps erstellt, Sequenzierungen nochmal genauer betrachtet
-10 neue Klone mit (hoffentlich) PhyA-CFP-Plasmid gepickt und als ÜN-Kulturen (1-10) angesetzt
-ÜNK von Glycerinstock (von Urs) mit CFP-Ausgangsplasmid angesetzt
Fr, 14th Sept. 2007
Philipp (10.30-18.00)
-ÜNK´s 1,3,5,7,9 sowie CFP-Ausgangsplasmid geprept
-eigenen Glycerinstock mit CFP-Plasmid angelegt
-ÜNK´s 2,4,6,8,10 abzentrifugiert und eingefroren
-Verdau (HindIII) und Analysegel für o.g. Preps um Einbau von PhyA zu prüfen:
positiver Befund für Klone 3,7,9
-diese zum Sequenzieren abgegeben
Sa, 15th Sept. 2007
Philipp(14.00-18.30)
-Präparativer Verdau des CFP-Ausgangsplasmids (Vektors) mit EcoRI & SpeI
So, 16th Sept. 2007
Philipp (16.00-18.30)
-Prep-Gel gegossen und mit Verdau vom 15.09. (CFP-Vektor) laufen lassen; leider keine
Bande zu erkennen (nur "Schmier",Konzentration wohl zu gering/"Star-Aktivität"?...)
-Sequenzierungen vom 14.09. (PhyA-CFP...) ausgewertet; erster Eindruck nicht schlecht...
Mo, 17th Sept. 2007
Philipp(12.00-17.00)
-Testverdau/Analysegel vom 14.09. (PhyA-CFP mit HindIII) wiederholt, positiv
-betroffene Proben (3,7,9) nochmal mit pQE-RP sequenzieren lassen
-Planung, Ansatz der Vorkultur für eine Expressionskultur mit dhfr1-4/6calmo4/6-dhfr2
Di, 18th Sept. 2007
Philipp(10.00-21.00)
-Expressionskultur (RV308 mit dhfr1-4/6-calmo-4/6-dhfr2) hochgezogen, abzentrifugiert, eingefroren
-Wachstums-Vortest (s.o.) in M9-Minimalmedium angesetzt (M9; M9 mit TMP; M9 mit TMP+CaCl)
Mi, 19th Sept. 2007
Philipp(11.00-16.00)
-Auswertung der RP-Sequenzierung von PhyA-CFP vom 17.09.; offenbar scheint PhyA am
N-Terminus mit CFP ligiert zu sein... ->Neuansatz einer 10ml ÜNK mit CFP-Glycerinstock von Urs
-Protokoll/Graph/Journaleintrag zur Expressionskultur vom 28.09.
Do, 20th Sept. 2007
Philipp(10.30-20.00)
-Spinprep von pAR200-cJun-CFP
-iGEM-Vortrag gehört
-SDS-Gel mit dhfr-4/6calmo laufen lassen, ge- und entfärbt, gescant
-OD der M9-Kulturen gemessen -> Vortest gibt Anlass zur Hoffnung auf Funktion...
-Besprechung (Jamboree, Arbeitszeiten)
Fr, 21th Sept. 2007
Philipp(11.00-12.30)
-SDS-Gel (jetzt fertig entfärbt) gescant
-nach langer Suche alle dhfr-Daten im blac-Ordner gefunden!?
-dann Peptidinfo-Sheet generiert
So, 23th Sept. 2007
Philipp(14.30-20.00)
-Verdau(EcoRI,SpeI)des CFP-Vektors wiederholt, Gel (5 Banden statt 2!?), Extraktion
-Ansatz einer neuen ÜNK für dieses Plasmid (Glycerinstock von Urs, diesmal ein anderer...)
-Ansatz eines weiteren Wachstums-Vortests (bzw. der Gegenprobe mit dhfr-winzip) in M9 für dhfr1-4calmo4-dhfr2
Mo, 24th Sept. 2007
Philipp(11.00-20.00)
-Puffer für Proteinreinigung angesetzt
-dhfr1-6calmo6-dhfr2 fraktioniert über Ni-NTA-Säule gereinigt
-ÜNK mit pAR200-JunW-CFP abzentrifugiert...
-OD der gestern angesetzten M9-Kulturen gemessen->Hoffnung wächst...
Di, 25th Sept. 2007
Philipp(09.00-14.30)
-SDS-Gel mit gereinigtem Protein (dhfr-4calmo..; vom 24.09.) laufen lassen
-Wachstums-Vortest in M9 bei verschiedenen Ca2+-Konzentrationen angesetzt
-ÜNK von RV308 mit dhfr1-4calmo4-dhfr2 angesetzt
Mi, 26th Sept. 2007
Philipp(12.30-17.00)
-OD´s der M9-Hintergrund-Testkulturen vom 23.09. gemessen->wie´s aussieht kein Hintergrund!!
-dhfr-4calmo-ÜNK geprept
-SDS-Gel ausgewertet, gescant
-Peptidinfo´s berichtigt...
Do, 27th Sept. 2007
Philipp(14 Uhr)
-OD´s der M9-Kulturen vom 23. sowie 25.09.gemessen(bestes Wachstum bisher bei 1,6mM Ca2+)
Mo, 01st Okt. 2007
Philipp(11.00-17.30)
-Verdau (KpnI/SpeI),Gel,Extraktion,Konz.best. von Calmodulin (Insert) und blac1-winzip-blac2(Vektor)
-Neuansatz der M9-Ca2+-Verdünnungsreihe
Di, 02nd Okt. 2007
Philipp(...)
-OD´s der M9-Kulturen vom 01.10. gemessen
Mi, 03rd Okt. 2007
Philipp(16.00-19.00)
-weiter OD´s der M9-Kulturen vom 01.10. gemessen, klarer Zusammenhang zwischen
Ca2+-Konzentration und Wachstum zu erkennen->"dhfr-4calmo" scheint zu funktionieren!
-Maps für die Synthese der dhfr1-4calmo4-dhfr2 iGEM-parts erstellt
Do, 04th Okt. 2007
Philipp(12.30-21.30)
-immer noch OD´s gemessen
-Sequenzen für die Synthese fertig gemacht.
