Freiburg07/labnotes
From 2007.igem.org
Fri, 3rd August 2007
workers: Natalia, Moritz
assessment of the 9 colony o/n cultures with 2,4,6 aa linker calmodulin
Sat, 4th August 2007
Philipp (12-14Uhr):
-Evaluation of the overnight-background-tests with the beta-lactamase/calmodulin-constructs in e.coli
-Centrifugation and labeling of the o/n cultures (of e.coli) containing various iGEM-parts
Mon, 6th August 2007
11 bis 14 Uhr
Anwesend: Corinna, Dario, Kristian, Moritz, Natalia, Philipp
Besprechung der Ergebnisse der letzten Woche
Schnittstellenplanung für spezifische iGEM-Schnittstellen:
- ca. 20% geschafft
blac1-calmodulin-blac2:
- Test für Hintergrund bis zu Amplcilin-Konzentrationen von 200 µl/ml; alle positiv!
PCB-Planung:
- Anfragen für feritges Plasmind per E-Mail; Warten auf Antwort
- Planung für Klonierung aus iGEM-Kit steht, falls wir das Plasmid selbst zusammenbasteln müssen
dhfr1-winzip-dhfr2a:
- Die letzte Sequenzierung zeigte Felher im Konstrukt. Für eine neue Sequenzierung wurden eine anderer Klon gepicked. Die DNA für die nächste Sequenzierung wurde bereits geprept.
Planung Fhy1 und PhyA:
- mögliche Kombinationen wären: dhfr1-Fhy1; PhyA-dhfr2; blac1- Fhy1; PhyA-blac2; Kombinationen mit YFP/CFP werden vielleicht von Urs zusammenkloniert
Planung der Arbeit für die laufende Woche ( 6.8. bis 10.8.2007 )
1. Testverdau und Sequenzierung des Plasmids pFR320dp-blac1-winzip-blac2 (Philipp)
2. Testverdau und Sequenzierung des Plasmids pFR320dp-blac1-calm-blac2 mit 3 verschiedenen Linkerlängen (Natalia, Dario)
3. Primer von PhyA und Fhy1 für PCR planen (Moritz)
4. PCB-Enzyme aus iGEM-Kit zusammenklonieren (Moritz)
5. Reinigung der Konstrukte:
Ansetzten der Übernachtkultur und einer Expressionskultur (Corinna)
Messung der OD und Zellernte (Philipp, Dario)
Dialyse (Philipp, Max)
6. Digitalisierung der Laborjournals (Corinna, Natalia)
7. Hintergrundtest für ein Konstrukt - 4GlyLinker- wiederholen (auf Platten) bei Konzentrationen von 50, 100, 200 und 400 µg/ml Ampicilin (Max)
8. Testverdau und Sequenzierung des Plasmids blac1-winzip-dhfr2 (Dario, Natalia)
Zeitplan der laufenden Woche
Moritz: 9 bis 14 Uhr
Dario: 9 bis 17 Uhr(Mo, Mi, Fr)
Philipp: 17 bis 18 Uhr
Corinna: 18 bis 19 Uhr
Natalia: 9 bis 14 Uhr
Max: ???
Philipp:
Planung und Ansatz des erneuten Testverdaus von dFR320dp-blac1-winzip-blac2, diesmal mit BssSI
Corinna
19.00 Uhr: Verdau-Ansatz von pFR320dp-blac1-winzip-blac2 aus 37 °C-Raum gegholt und Testgel bei 100 V laufen gelassen
20.15 Uhr: Photo von Gel aufgenommen; Auswertung: nur 1 Bande zwischen 2500 und 3000 bp zu erkennen; die eigentlich erwarteten kleineren Banden sind weder auf dem Photo noch im Gel zu erkennen. Evtl. war die eingesetzte DNA-Kontentration zu gering, die große Bande war auch nur relativ schwach zu sehen.
21.00 Uhr: Protokoll des Treffens digitalisiert
Di, 7th August 2007
10 bis 15 Uhr
Moritz: Planung der Klonierung von iGEM Parts für PCB Synthese.
Verdau von folgenden iGEM Parts:
B0034 mit SpeI und PstI (Vektor)
I15008 mit XbaI und PstI (Insert1)
I15009 mit XbaI und PstI (Insert2)
Verdau ab 14 Uhr im 37 Grad Raum!
10 bis 15 Uhr
Natalia:
Plasmidkarten erstellt:
1. pFR320p_b1_2calmo2_b2
2. pFR320p_b1_4calmo4_b2
3. pFR320p_b1_6calmo6_b2
alle Plasmidkarten sind im neuen Ordner bla_calm_bla
Testverdau geplant.
18.30 Uhr
Corinna:
Verdau aus 37 °C-Raum geholt und eingeforen bei -20 °C
Mi, 8th August 2007
Moritz (9 - 15.30 Uhr):
- Planung PhyA und FHY1 PCR
- Prep. Gel für Verdau von iGEM Parts: Vektor und Insert1 bzw. Insert2 ausgeschnitten
- Gelextraktion von Vektor, Insert1 und Insert2
- Konzentrationsbestimmung der geprepten DNA
- Ligation (2Ansätze): Vektor(pSB1A2/B0034) + Insert1(I15008) bzw. Insert2(I15009)
Max (12 - 16.20 Uhr):
- Amplifikation von b1-calmo-b2 Glycerin-stock Zellen
- Vorbereiten von Agar-Platten mit unterschiedlichen AMP Konzentrationenbr( Hintergrundtest)
- Ausstreichen der amplifizierten b1-calmo-b2 zellen auf je 3 Amp-Platten (37°C Raum über Nacht)
Natalia (9-14 Uhr
- Planung und Ansetzen des Testverdaus für pFR320p_b1_#calmo#_b2
- Planung und Ansetzen von Testverdau für Plasmid dFR320_b1_winzip_dhfr2a
Dario (14-18):
- Planung und Ansetzen von Testverdau für Plasmid dFR320_b1_winzip_dhfr2a
- Gellauf des Testverdaus von Plasmid pFR320_b1_#calmo#_b2
- Auswertung des Testgels
Corinna (15-16 Uhr):
- Ansatz einer über-Nacht-Kultur von Zellen mit pFR320dp-blac1-clamo-blac2 (Linkerlänge 4AS) bei 28 °C
Do, 9th August 2007
Gruppenbespechung (12 - 14 Uhr)
Anwesend: Natalia, Corinna, Dario, Moritz, Max, Philipp
Allgemeine Sachen:
- Eppis besser beschriften (Datum, Plasmid/Zellen, wurde Testverdau/Sequenzierung gemacht, bei Fragmenten Enzyme angeben
- Liste von Inhalt der Boxen erstellen (Dario)
- Anlegen einer neue Box nur für Plasmide
Ergebnisse seit dem letzten Treffen und weitere Planung:
1. Testverdau und Sequenzierung pFR320dp-blac1-winzip-blac2:
- unklares Ergebnis; Testverdau wiederholen: aus Glycerinstock eine Über-Nacht-Kultur ansetzten - Miniprep - Verdau (Philipp, Natalia)
2. Testverdau und Sequenzierung pFR320dp-blac1-calmo-blac2:
- unklares Ergebnis; Testverdau mit mehr DNA und mehr Enzym wiederholen, Gel nicht zu lange laufen lassen
3. Primer für PhyA und Fhy1: läuft (Moritz)
4. PCB: läuft (Moritz)
5. Reinigung des Konstrukts blac1-4-calmo-4-blac2:
- kaum Wachstum in der Über-Nacht-Kultur; angeimpfte Expressionskultur wächst ebenfalls sehr langsam
mögliche Erklärungen: falsches Plasmid, falsche CAM-Konzentration, Temperaturabhängigkeit (28 °C!) der Plasmidkopien, XL-1 blue, toxisches Produkt; Zellen wachsen anscheinend sehr langsam
Sonntag: von allen 3 Konstrukten Über-Nacht-Kulturen von Klon 1 ansetzen (Corinna)
6. Digitalisierung: läuft (Natalia, Corinna)
7. Hintergrund-Test (AMP):
- Wachstum bei allen Konstrukten und allen getesteten Konzentrationen, konstitutive Aktivität?
8. Testverdau und Sequenzierung pFR320dp-blac1-winzip-dhfr2: Gel wird gerade ausgewertet (Dario)
neues Projekt:
- kleines Lactamase-Fragment aus dem Plasmid entfernen (Umklonierung)
Moritz (9.30 - 15 Uhr):
- Transformation der Ligation in RV 308 (chem. kompetent):
es wurde die Ligationen Vektor + Insert1 (pSB1A2/B0034 + I15008),
sowie Vektor + Insert2 (pSB1A2/B0034 + I15009) transformiert.
- Besprechung mit Kristian wegen Primern für FHY1 und PhyA:
es besteht noch weiterer Planungsbedarf da die Primer kompliziert aufgebaut sind :-P !!!!
Corinna (8.00 - 9.30 Uhr):
- In der über-Nacht-Kultur war in einem Ansatz nur eine sehr geringe Trübung als Zeichen für Wachstum zu erkennen, im anderen Ansatz war das Medium sogar noch klar.
- Trotzdem: Ansatz der Expressionskultur für die anschleißende Reinigung des Konstrukts blac1-4calmo4-blac2
Dario (8.30 - 16 Uhr):
- Gel laufen lassen von Testverdau für Plasmid dFR320_b1_winzip_dhfr2a mit KpnI und AflIII, Auswertung zeigte
die von uns geplannte Banden
- Gellauf des Testverdaus von Plasmid pFR320_b1_#calmo#_b2 ausgewertet und die von uns geplanten Banden
waren nicht zu erkennen, mögliche Fehlern: Gel zu lang laufen lassen oder Volumen an Plasmid
- Wiederholung von Testverdaus von Plasmid pFR320_b1_#calmo#_b2 mit SpeI und KpnI. Noch nicht ausgewertet
- Messung von Optische Dichte (OD) von Expressionskultur pFR320p_blac1_4calmo4_blac2 (von Corinna):
OD Werte waren sehr niedrig und ist gar nicht gewachsen. Muss wiederholt werden. Wird wahrscheinlich
mit pFR320p_blac1_2calmo2_blac2 wiederholt
Max (12 - 16Uhr):
- Auszählen der verschieden konzentrierten AMP platten mit b1-calmo-b2 konstrukten ergab, dass alle platten
übertrieben bewachsen wahren und keine Aussage über die Funktionalität der unterschiedlichen Konstrukte
getroffen werden konnte. Grund dafür ist wohl fehlerhaftes Ampicilin , dass für die Platten verwendet wurde!
- Ansetzen von 20 1ml Aliquots Ampicilin (100 mg/ml) für neue platten und verdünnungstestreihe der konstrukte
Philipp (12-16Uhr):
- Ansatz der ÜNK von Klon B1 (Glycerinstock) zur Auffrischung des Bestandes an pFR320dp-blac1-winzip-blac2
-Verschiedene kleinere Arbeiten (Etikettieren, Boxen, Auswertung...)
Fr, 10th August 2007
Moritz (9 - 14 Uhr):
- Ansetzen einer Übernachtkultur von Trafo - Platten:
Die Platten waren dich bewachsen! Es könnte sich um Platten mit fragwürdigem Amp handeln (leider habe ich es zu spät gemerkt) und dadurch könnten die Colis (RV 308) das Plasmid verloren haben!! Die Vermutung liegt nahe, da in der ÜNK noch keine Zeichen von Wachstum zu erkennen sind (nach 3,5 Stunden).
- Planung der Primer (PhyA u. FHY1) fast abgeschlossen (werden noch mit gcg ausgewertet und Kristian muss noch sein OK geben).
Max (13.30 - 16.30 ):
- Aufzucht von b1-calmo-b2 zellen mit 2,4 und 6 Glycinen linker aus den Glycerin stocks für 1 Stunde
- Giessen neuer Platten mit je 25µg CM und 50µg, 100µg, 200µg sowie 400µg Amp, für eine neue Verdünnungs-testreihe
- Ausplattieren der angereicherten b1-calmo-b2 Zellen auf den Platten; Bebrütung bei 37°C über Nacht
Natalia (9-14Uhr)
- Plasmid dFR320d_b1_wz_dhfr2 zum Sequenzieren abgegeben
- ÜNK geprept und die Konzentration bestimmt
- Bestimmung der Konzentration von der Expressionskultur
Corinna (15.00 - 17.00 Uhr):
- Kulturen (von Moritz) aus 37 °C-Raum geholt. In allen 6 RGs sind die Zellen gewachsen.
- Anlegen von Glycerin-Stocks
- Miniprep von allen Proben
Sa, 11th August 2007
Max (12.30 - 14.00 uhr):
- Auszählen der Platten mit den unterschiedlichen Amp Konzentrationen; Dabei war ein Trend der Zellen mit 2- und 6 Glycinen Linker zu erkennen, bei höheren Amp konzentrationen schlechter zu wachsen! Die Zellen mit 4 Glycinen als Linker zeigten überhaupt kein wachstum auf 50, 200 und 400 µg Amp wobei auf 100 µg nur 4 veeinzelte klone zu sehen waren. Mit Klon 1 b1- 4calmo4 -b2 sollte eine weitere Verdünnungsreihe unter Zugabe verschiedener Calciumtiter durchgeführt werden!
So, 12th August 2007
Corinna: (13.00 -14.15 Uhr)
- Ansatz von Ü/N-Kulturen aus Glycerinstocks von Zellen mit allen 3 Linkerlängen (immer Klon 1 verwendet)bei 28 °C; es soll das Wachstum beobachtet werden, da bei der letzten Ü/N-Kultur (Linkerlänge 4 AS)nach über 16 h kaum Zellen gewachsen sind.
Mo, 13th August 2007
Besprechung (12.00 bis 14.00 Uhr)
Folgende Probleme wurden festgestellt:
1. Testverdau der blac1-calmo-blac2 Konstrukte zeigt nur religierten Vektor
- neue Ligation von pFR320dp-blac1-winzip-blac2 und Calmodulin aus PCR (KpnI und SpeI)
- anschließende Transformation
- je 6 Klone von der Platte picken, davon je 3 prepen
- Testverdau von insgesamt 9 Klonen
- Kontrolle der bisherigen Arbeitz für dieses Konstrukt:
05.7.07 - Testverdau von pFR320dp-blac1-winzip-blac2
20.7.07 - Sequenzierung
26.7.07 - PCR für Calmodulin; Verdau des Vektors mit KpnI und SpeI
27.7.07 - Reinigung Calmodulin
31.7.07 - Testverdau pFR320dp-blac1-winzip-blac2, B.2 Klon zeigte richtige Sequenz; Ligation
01.8.07 - Transformation in RV308 und XL-1
02.8.07 - Auswertung der Transformation; Picken und ansetzen von über-Nacht-Kultur
03.8.07 - Spinprep
2. Klone wachsen im Flüssigmedium, aber nicht auf Platten
Weitere Schritte:
- Verdau des Vektors pFR320dp-blac1-w-blac2
- PCR dhfr1 für pFR320-blac1-winzip dhfr2
Moritz (9-14.30 Uhr):
- Preparativer Verdau von Vektor1 (Plasmid mit PBAD) und Insert1 (Plasmid mit RBS + HO1)
- Preparativer Verdau von Vektor2 (Plasmit mit Terminator) und Insert2 (Plasmit mit RBS + PcyA)
Enzyme: Vektor1 mit SpeI, PstI. Insert I mit PstI, XbaI. Vektor2 mit EcoRI, XbaI. Insert2 mit EcoRI, SpeI.
Natalia (11.00 - 11.30)
- Ansetzen neuer Expressionskultur
Max (12.30 - 16.30 uhr):
- Präperativer Verdau des pFR 320p b1- wz -b2 Vektors mit SpeI und KpnI
- Planung und Ansetzen einer PCR für dass Dhfr1 - Fragment aus dem ausgangsvektor Nr. 183
- sich aufgeregt
Di, 14th August 2007
Moritz (10-13 Uhr)
- Prep. Gel: Auswertung hat mich dazu veranlasst mit der Klonierung der iGEM Parts von weiter vorne neu zu beginnen!!!
- Ligation(2Ansätze): Vektor(pSB1A2/B0034) + Insert1(I15008) bzw. Insert2(I15009)
Max (12 - 16 Uhr):
- Laufen des Präperativen Gels mit dem Dhfr- Fragment 1 sowie dem präperativen Verdau von Vektor
pFR 320p b1- wz -b2
- Die Auswertung des Gels war positiv und es konnten die gewünschten Banden eluiert werden
- Der Vektor pFR 320p b1- wz -b2 wird vor der Ligation mit den Calmodulin Konstrukten Dephosphoryliert (Natalia)
- wieder aufgeregt
Natalia (11:00 -12:00; 14:30 - 18:00)
- OD der Expressionskultur gemessen
- Dephosphorylierung des Vektors: pFR320p_b1_wz_b2
- Ligation der Calmodulinkonstrukte
- Präparativer Verdau von dhfr1
Mi, 15th August 2007
Moritz (9.30- 17.30 Uhr):
- Transformation der Ligation (Ligation(2Ansätze): Vektor(pSB1A2/B0034) + Insert1(I15008) bzw. Insert2(I15009))
- die Primer für PhyA und FHY1 müssen mal wieder neu geplant werden, da wir die iGEM kompatiblen Parts über Gensynthese bestellen und den Rest nur für uns machen (ohne iGEM Schnittstellen!!!)
Dario (12.00 bis 18 Uhr):
- Reinigung der PCR-Produkte von Dhfr1-Fragment
- Moritz helfen beim Digitalisirung der PhyA und FHY1 Primer Sequenzen
Natalia (9:30 - 12:00)
- Transformation der Ligation vom 14/08/07
- Vektorverdau b1_wz_dhfr2 angesetzt
Do, 16th August 2007
Moritz (9.30 - 15.30 Uhr):
- ÜNK der Transformation (pSB1A2/B0034/I15008 bzw. pSB1A2/B0034/I15009), wenns denn funktioniert hat.
- Fertigstellung der Primer (nach 1000 Jahren) und Bestellung bei Käptäääään Igloi
Natalia (9:30 - 15:30)
- Gel laufen lassen mit dem Verdau vom 15/08/07
- Banden ausgeschnitten und anschließend gereinigt
- Auswertung der Trafo-Platten
- Ligation von b1_wz_dhfr2-Vektor + Insert (dhfr1), zusätzlich eine Negativ-Probe
Max (12 - 16 uhr):
- von den b1- #calmo# -b2 transformationsplatten vom 15/08/07 wurden je 3 klone gepickt und Übernachtkulturen mit diesen angesetzt
- Vorbereiten neuer AMP - Verdünnungsplatten mit 50, 100, 200 und 400µg AMP sowie je 25µg CM pro Platte (im 4°C Raum bis zur verwendung aufbewahrt!)
Fr, 17th August 2007
Moritz (9.30 12 Uhr):
- Spin Prep der ÜNK und Anlegen von Glycerin Stock
Natalia (10 - 12.30 Uhr):
- Transformation von Plasmid mit dhfr1-winzip-dhfr2br
Max Vormittag (10 - 13.45 uhr):
- Von den Übernachtkulturen vom 16/08/07 der unterschiedlichen Calmodulin - Konstrukte ( 2, 4 und 6 Glycine linker) wurde jeweils ein Glycerinstock angelegt
- Klon Nr 3 jedes Konstruktes ( 2, 4 und 6 Glycine linker) wurde nur runterzentrifugiert und dass pellet so eingefroren
- Klon Nr 2 und Nr 1 wurden mit QIAGEN Plasmid mimiprep-kit bearbeitet und so die Plasmid DNA eluiert, mit welcher anschliessend ein Testverdau mit KpnI und SpeI angesetzt wurde
- nicht mal richitg aufgeregt
Nachmittag (16 - 19 uhr):
- Ansetzen von 2 mL Kulturen der Glycerinstocks b1 - calmo - b2 (mit 2, 4 und 6 Glycinen) um diese im Fall eines positiven Testverdaus auszuplattieren
- Gellauf des Testverdaus für 45 Minuten; Im Gel waren ausschliesslich die gewünschten Banden zu erkennen, woraus sich schliessen lässt dass die Ligation diesmal erfolgreich war!
- Ausplattieren von Klon Nr 1 der hochgezogenen Zellen (ca 1 Stunde Wachstum!) auf den AMP - Verdünnungsplatten vom 16/08/07; Bebrütung bei 37° über Nacht (Platten dabei immer auf den Kopf stellen!)
Mo, 20th August 2007
Max (12 - 14 uhr):
- Auszählen der AMP - Verdünnungsplatten vom 17/08/07; Nur der Klon mit 2 Glycinen Linker zeigte auf der Platte mit 50 µg 46 Kolonien, auf der Platte mit 100 µg wuchs eine einzelne kolonie. Alle anderen Platten waren vollkommen unbewachsen, woraus sich schliessen lässt, dass diese Klone nicht in der Lage sind AMP abzubauen!
- Ansetzen einer 50 mL ÜNK des Klons Nr 1 mit 4 Glycinen Linker als Expressionskultur
- Abgabe der Calmodulin Konstrukte mit 2, 4 und 6 Glycinen Linker zum Sequenzieren; Es wurde hierfür immer Klon Nr 1 abgegeben; Auswertung sollte nach Möglichkeit bitte jemand anders machen, da ich ab morgen auf Urlaub bin;)
Natalia, Dario (13 - 16)
- Amplifikation der dhfr1_wz_dhfr2 Klone
- es wurden 6 Große und 6 kleine Klone von der Platte mit der Ligation v. Klon2 gepickt
- Auszählen der Platten (danke Dario)
Gruppenbesprechung: (13.30-14.30)
Anwesend: Natalia, Max, Dario
Plannung der nächsten Tage
1. Von Konstrukt b1_calmo_b2:
-Sequenzierung Auswerten
-Wachstumstest auf Platten mit verschiedene Konzentrationen von Ca2+, IPTG und Amp
0 0,1 1 10 mM Ca2+
0,5 0,5 0,5 0,5 mM IPTG
50 50 50 50 mg/ml Amp
(Platten pro Konstrukte)
- Plannung der Expressionkultur von b1_calmo4,4_b2
- Konstrukte Reinigen
- Reinigung der Periplasmatischeaufschuss
2.DHFR-Konstrukt.
- Klon auf Platten
Vektor Ligation zeigt ca.1/3 Hintergrund bei Klon 2
- Jetz werden 12 Klone gepickt und in Glycerinstocks aufbewahrt
- 6x der Klone werden Spin geprept und 6x Klone eingefroren
- Später alle 6x Testverdaut
- Klonierung der Calmodulin Fragmente werden nach der Testverdau gemacht
(KpnI/SpnI)
Di, 21th August 2007
Moritz (12-20.30):
- PCR für Phytochrom und FHY1 Inserts
Dario (12-20:30):
- Expressionskultur von b1_calmo_b2 Gly 4 (XL-1)
Natalia (9:30 - 21:00)
- Preppen der gepickten Klone vom 20/08/07
- von allen (12) Klonen wurde ein Glycerinstock angeleget
- Klone 3, 5, 6, 7, 9, 10 wurden runterzentrifugiert und eingefroren
- Klone 1, 2, 4, 8, 11, 12 wurden geprept und testverdaut mit EarI
- Gel laufen lassen mit dem Testveradu
- Präparativen Verdau mit Klon2 angesetzt
- Platten für den Wachstumstest geggossen
- Plasmidkarte für das Plasmid: dFR320d_dhfr1_wz_dhfr2A erstellt
Mi, 22th August 2007
Moritz (10-20 Uhr):
- Prepgel, Gelextraktion, Verdau und PCR Reinigungs Kit von PCR Produkten
- Planung für PCB Enzyme (mal wieder)
-Ligation von Fhy1 mit YFP (N- und C-Terminal)
-ÜNK von DHFR Plasmiden aus Labor Glycerin Stocks
Dario (9.30-21.00 Uhr):
- Transformation b1_calmo4,4_b2 Klon 1 in RV308
- Reinigung der Expressionskultur von b1_calmo4,4_b2 Klon 1 in XL-1
- Vorbereitung der Puffers für die periplasmatische Extraktion der Proteine von b1-cal4,4_b2 K1
Natalia (9:00 - 15:00)
- Sequenzierung von dhfr1_wzdhfr2 Klon 1/4
- Präparativer Verdau v.:21/08/07 Bande ausgeschnitten
- Präparativen Verdau mit Klon1/4 angesetzt
- Klon1/2/4 von dhfr1_wz_dhfr2 ÜNK angesetzt
- ÜNK von b1_2,4,6calmo246_b2 angesetzt
- Auswertung der Sequenzierung vom 10/08/07 v. dhfr2
Do, 23th August 2007
Beschprechung(14:30 bis 16:00 Uhr)
1. Bei pFR320p_b1_2,4,6_b2
- Sequenzen noch nicht Ausgewertet:
wird aber von Dario und Natalia gemacht
- Konstrukte auf Platten bei verschiedene Konzentrationen von Ca2+, IPTG und Amp müssen ausplattiert werden:
wird von Natalia gemacht
- Weiteres muss mit Jochen besprochen werden
- Transformation in BL21 mit pREP4
2. Bei DHFR1_wz_DHFR2
- Sequenziert: Austuach vn ein paar Basen aber außerhalb DHFR. Mögliche Fehler ist nicht von Konstrukt, sondern von der Plasmidkarte
- Verdau mit KpnI/SpnI geführt, War Positiv aber mit zusätzlichen Banden.
Jetzt muss kloniert werden.
3. Protein Reinigung
- 1. Versuch in XL-1
- Aktivitättest fehlt
4. PCR
- Mit Fhy1, Phy A und Fhy hat bis jetzt alles funktionirt (Verdaus und PCR)
- Jetzt muss Fhy1 mit YFP/YFP mit FHY/ PHy A mit CFP fusioniert werden
- Weitere Untersuchungen. Wird ein FRET durchgeführt (Aktivitätstest)
Dario (10.30-21.30 Uhr):
- Transformation b1_calmo4,4_b2 Klon 1 in RV308 wiederholt
- Reinigung der Expressionskultur von b1_calmo4,4_b2 Klon 1 in XL-1 weitergeführt
- Natalia helfen beim ausplattieren von der verschiedenen Calmo-Konstrukte bie verschiedene
Konzentrationen von Ca2+, IPTG und Amp
Natalia (9.30-21.30)
- Auswerten der Plasmidsequenzierungen von dhfr1_wz_dhfr2 Klon4 und Klon1
- Gel laufen lassen mit d. Präparativen Verdau von dhfr1_wz_dhfr2
- Vektorbande v. Klon4 ausgeschnitten, dephosphoryliert und eingefroren
- Messen der OD der UNK von b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 immer wieder verdünnt und anschließend auf Platten mit unterschiedlichen Konzentrationen (Calcium und Amp) ausgestrichen
Moritz (9.30 - 16.30 Uhr):
- Spin Prep der ÜNK (von Plasmiden aus Labor Gly.- Stock: 172, 179 und 183)
- Verdau der Plasmide (dienen als Vektoren für PhyA und Fhy1 Inserts)
- Trafo von YFP-Fhy1 (small und big), Fhy1-YFP (small und big), IGEM Part I0500 auf pSB2K3
Fr, 24th August 2007
Moritz (9-17 Uhr):
- Auswertung Trafo: IGEM Part nicht gewachsen, Fhy1 (big und small)- YFP nicht gewachsen, YFP-FHY1 gut gewachsen
- neue Trafo von iGEM Part in BL 21 Gold
- Prep.-Gel des Vektor Verdaus (172,179,183)
- neue Ligation von Fhy1-YFP Konstrukten, sowie von PhyA-CFP
Dario (12-16 Uhr):
- Auszählen und Aunswertung der Platten von bl_calmo2,4,6_b2 bei verschidene Konzentrartionen von Ca2+,
Amp und IPTG.
- PheBo loding Puffer für die Proteinreinigung von b1_calmo4_b2 in XL-1 gewechselt.
Natalia (9.00-11.00)
- erneut: Präparatiververdau von dhfr1-wz-dhfr2 Klon4
- dhfr1-wz-dhfr2 Klon1 und 2 wurden geprept und eingefroren
- Auswertung der ausplattierten Klone b1-2,4,6calmo2,4,6-b2
Sa, 25th August 2007
Moritz (11-14 Uhr):
- neue Trafo von YFP-Fhy1 und PhyA-CFP Konstrukten
- sowie neue Trafo von iGEM- Part I0500, da wieder nicht gewachsen!!!
---> leider wurden während der Transformation alle Trafo Ansätze aus dem 37 Grad Raum entwendet und sind nicht wieder aufgetaucht. Da ich den Vektor von Urs hatte konnte ich leider keine neue Tarfo ansetzen!!!
- Gelextraktion der Vektoren (172,179,183)
Mo, 27th August 2007
Moritz (11-17 Uhr):
- Dephosphorylierung der Vektoren (172, 179, 183)
- PCR für Fhy1 Inserts
- Trafo von iGEM Part I0500
- Ligation: Fhy1(big bzw. small)-YFP; YFP-Fhy1(big bzw. small); PhyA-CFP
Natalia, Corinna(9.00 - 16.00)
- gel: präparativer Verdau vom 24/08/07 ausgeschnitten und dephosphoryliert
- Sequenzierungen ausgewertetvon b1-2,4,6calmo2,4,6-b2
Di, 28th August 2007
Corinna, Natalia (9.30-22.30 Uhr):
- Auswertung der Sequenzierungen für die Lactamase-Calmodulin-Konstrukte (Linkerlänge 2,4,6 AS): viele Fehler im Calmodulin, Veilleicht aber auch nur Fehler in der Sequenzierung
- neue Proben zur Sequenzierung mit neuem Primer ca. 80 bp vorm Calmodulin abgegeben
- neue PCR für Calmodulin mit verschiedenen Linkerlängen; Reinigung der PCR-Produkte
- Verdau der PCR-Produkte mit KpnI und SpeI
- prep. Gel : Template-Banden waren zu erkennen, aber leider keine Produkt
- erneuter Ansatz der PCR; diesmal wurden die Vorverdünnungen von Primern und Template frisch hergestellt
Moritz (11-22.30 Uhr):
- Trafo der Ligation (Fhy1(big bzw. small)-YFP; YFP-Fhy1(big bzw. small); PhyA-CFP)
- Verdau der PCR Produkte, Prep.-Gel
- ÜNK der Trafo von iGEM Part I0500 , allerdings auf konzentrierter Platte nur 6 Kolonien gewachsen
- Ligation: Fhy1(big bzw. small)-dhfr1; dhfr1-Fhy1(big bzw. small); PhyA-dhfr2
Mi, 29th August 2007
Moritz(9.30-21.30 Uhr):
- ÜNK der Trafo (Fhy1(big bzw. small)-YFP; YFP-Fhy1(big bzw. small); PhyA-CFP)
- Trafo der Ligation (Fhy1(big bzw. small)-dhfr1; dhfr1-Fhy1(big bzw. small); PhyA-dhfr2)
- Spin Prep der ÜNK (Fhy1(big bzw. small)-YFP; YFP-Fhy1(big bzw. small); PhyA-CFP)
Natalia, Corinna (9.30-16.00)
- Reinigung der PCR-Produkte
- analytisches Gel laufen lassen
- Verdau der PCR-Produkte und Präparatives Gel
- Ligationsansatz
Do, 30th August 2007
Moritz (10.30-15.30 Uhr):
- Auswertung der Trafo Platten (Fhy1(big bzw. small)-dhfr1; dhfr1-Fhy1(big bzw. small); PhyA-dhfr2)
- ÜNK von Trafo
- Abgabe Sequenzierung (Fhy1(big bzw. small)-YFP; YFP-Fhy1(big bzw. small); PhyA-CFP)
- Erstellung von Plasmidkarten (Fhy1(big bzw. small)-YFP; YFP-Fhy1(big bzw. small); PhyA-CFP)
Corinna, Natalia (9.30-11.30)
- Transformation der Ligation dhfr1-2,4,6calmo2,4,6-dhfr2 ; b1-2,4,6calmo2,4,6-b2
Fr, 31th August 2007
Moritz (10.30 U- 18.15 Uhr):
- Spin Prep der ÜNK (Fhy1(big bzw. small)-dhfr1; dhfr1-Fhy1(big bzw. small); PhyA-dhfr2)
- Auswertung der Sequenzierung (Fhy1(big bzw. small)-YFP; YFP-Fhy1(big bzw. small); PhyA-CFP):
-> leider bin ich mit der Auswertung nicht ganz fertig geworden. die übereinander gelegten Sequenzen befinden sich im Klonierordner.
Corinna, Natalia (10-12)
- Amplifikation gepickter Klone
Wichtig: Lesen und Kristian zeigen (PhyA und Fhy1 Projekt)
Fhy 1 habe ich in 2 Versionen PCRt, einer kleinen (small) und einer grossen (big). Beides ist als fertig verdautes Insert vorhanden (Fhy1-big bzw. Fhy1-small). Falls es ausgehen sollte kann es mit dem PCR Rezept aus dem Laborjournal wieder hergestellt werden (Verdauen nicht vergessen). Das Gleiche gilt für PhyA. Allerdings existiert von PhyA nur eine Version. Beim Klonieren beachten, dass der N-Terminus von PhyA frei bleiben muss.
Für das PhyA-CFP, Fhy1-big und small-YFP Projekt ist Urs euer Ansprechpartner. Er würde auch bei der Proteinisolierung helfen. Ich habe fertige Plasmide (von denen das Sequenzierungsergebnis oben steht) und Glycerin Stocks(XL-1). Beachtet bitte dass ihr bei einer Expressionskultur die fertigen Plasmite erst in BL-21 transformieren müsst (für Trafo bitte nicht mehr als 1-2 microliter nehmen). Ein Problem haben wir allerdings. Die Klonierung der PCB Synthese Enzyme habe ich aufgeben müssen, da der Promotor (PBAD/AraC) vermutlich nicht auf einem Kanamycin-Resistenz Plasmid befunden hat (wie von iGEM angegeben). Zumindest ist auf Kanamycin bei drei Trafo Versuchen nichts gewachsen. Die Enzyme (HO1 und PcyA) mit Ribosomenbindestelle liegen vor und könnten also noch fertiggestellt werden (Promotor??). PCB muss den E. Colis in einer Expressionskultur gefüttert werden, wenn sie es nicht selbst herstellen können. Von einem Kollegen von Herr Kircher habe ich etwas PCB bekommen. Dieses PCB soll, man wenn man es benutzen will, mit 100 Microlitern DMSO verdünnen und erhält dann eine Konzentration von 10.7 mM (diese Konz. steht auf dem Eppi drauf). Das PCB muss vor Licht geschützt werden (viel Spass dabei und bei Verwendung unbedingt mit Kristian absprechen). In der Expressionskultur sollte eine Konzentration von 1-5 micro Molar an PCB sein (zu viel kann toxisch sein). Ich habe nicht ausgerechnet ob es für eine Expressionskultur reicht, aber ich glaube eher nicht. Falls Herr Kircher uns kein weiteres PCB gibt, müssen wir auf die von Kristian bestellten Plasmide mit den PCB Biosynthese Enzymen warten.
Desweiteren habe ich PhyA mit dhfr2 zusammenkloniert sowie Fhy1 Konstrukte mit dhfr1 N- und C-Terminal. Diese sind geprept (von jedem Konstrukt 3 Klone + Glycerin Stock (XL-1)) und müssen getestet werden (Testverdau und Sequenzierung). Falls die Tests alle positiv sind, kann man auch hier eine Expressionskultur starten. Die Plamidkarten müssen noch erstellt werden, leider bin ich nicht mehr dazu gekommen. Für YFP-CFP Konstrukte habe ich die Plasmidkarten im Phytochrom Ordner. Bitte PhyA-YFP Klone noch mit pQE-RP Sequenzieren lassen, da PhyA etwa 1200 bp gross ist!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
Die Tests muss man vermutlich alle bei Herr Kircher im Labor machen!
Viel Glück und behandelt meine Babys gut ;-) !!!!!
Sa, 1st Sept.2007
Natalia (14.30-17.30)
- Glycerinstock d. amplifiz. Klone
- Klone 1,2 von dhfr1-2,4,6calmo2,4,6-dhfr2 b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 geprept
- klon 3 von dhfr1-2,4,6calmo2,4,6-dhfr2 b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 runterzentrifugiert und eingefroren
Mo, 3rd Sept. 2007
Natalia (10.30-19.00)
- Plasmidkarten für dhfr1-2,4,6calmo2,4,6-dhfr2 erstellet
- Testverdau: dhfr1-2,4,6calmo2,4,6-dhfr2
- Miniprep: dhfr1-6calmo6-dhfr2 Klon3, b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 Klon3
- Sequenzierungen vom 01.09.07 ausgewertet
- zum Sequenzieren abgegeben: dhfr1-2,4calmo2,4-dhfr2 Klon1,2
Mo, 4th Sept. 2007
Natalia (10.30-19.30)
- Testverdau für b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 dhfr1-6calmo6-dhfr2 Klon3 angesetzt, laufen lassen und ausgewertet
- erneute Ligation mit b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 angesetzt
- Präparativer Verdau: b1-wz-b2 angesetzt, da Vektor fast leer ist
- mein Hirn mit Sequenzierungen gequält (Auswertung von dhfr1-2,4calmo2,4-dhfr2 Klon2,1)
- zum Sequenzieren abgegeben: dhfr1-6calmo6-dhfr2 klon3, dhfr1-4calmo4-dhfr2 Klon1
- für Phillipp: yfp big und small amlifiziert: je 5 Klone
Mittwoch, 5th Sept. 2007
Natalia (10.00-18.00)
- Transformation der Ligation von b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 in XL-1
- neue Platten mit Cmp gegossen
- parallel zur Ligation wurden 8 weitere Klone (Trafo vom 31.08.07) von b1-2,4,6calmo2,4,6-b2 gepickt
- Ptäparatives Gel (b1-wz-b2 - Vektorverdau) auf dem Gel aufgetragen, die Banden ausgeschnitten und gereinigt
