Chiba/Quorum Sensing

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  3.Receiverに取り込まれたAHLはReceiver内で発現されるLuxRと結合しlux promoterを活性化する。
  3.Receiverに取り込まれたAHLはReceiver内で発現されるLuxRと結合しlux promoterを活性化する。
  4.lux promoter下にあるGFPが発現する。
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==Experiments==
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Our Aim

About Quorum Sensing

クオラムセシングの説明

Quorum sensing system.jpg


SenderはLuxIを発現するSenderはAHLを合成する。細胞膜を通り抜け細胞外にAHLは拡散していく。

ReciverはLuxRを発現しLux promoterを含む遺伝子回路を持つ。細胞膜を通り抜けてきたAHLはLuxRと結合して、Lux promoterを活性化する。

上の回路では

1.Sender内でLuxIが発現しAHLが合成される。
2.Senderの細胞膜を通り抜けたAHLはReceiverの細胞の中に取り込まれる。
3.Receiverに取り込まれたAHLはReceiver内で発現されるLuxRと結合しlux promoterを活性化する。
4.lux promoter下にあるGFPが発現する。


Parts Assembly

Experiments

AHL生産能力 Assay

Quorum Sensingをスイッチとして利用するために以下の実験をした。

  • pLuxをアクティブにするためにはどのくらいのSenderが必要なのだろうか
  • SenderとしてAHLを生産する能力の高い株は?(SenderとしてLuxIを発現する株はどのようなものがいいのか)
  • AHLのprecursurであるMethionineを培地に加えることで,Senderはより多くのAHLを合成するのだろうか?
    • AHL合成経路

AHL syn picture.jpg

Result

To Make an AHL Concentration Gradient

  • aiiA (autoinducer inactivation enzyme A): degradate AHLs.
  • aiiAを発現させ、AHLが広がりすぎないようにする
  • aiiAをpluxとinverterの下に置き、AHLが低い濃度ではaiiAを発現させAHLを分解させ、高い濃度ではaiiAが発現しないような回路を作る。
    • thresholdの境がもっとはっきりするようになるだろう。

Rec inv aiia.jpg


Improving Sender & Receiver

Super Sender

  • SenderがもっとAHLを合成するようにする。
    • AHL合成経路でS-adenosyl Methionineのをさらに合成させることでAHLの量を増やす。
metKを発現するSenderの回路を作る。

Super Receiver

  • Receiverをもっと高感度にする。
    • 論文で読んだmutant LuxRを作成し、AHLの濃度が低くてもpLuxを活性化する。

(Collins, C. H., Arnold, F. H. & Leadbetter, J. R. Directed evolution of Vibrio fischeri LuxR for increased sensitivity to a broad spectrum of acyl-homoserine lactones. Mol. Microbiol. 55, 712–723 (2005).)

LuxRのアミノ酸 Ile45->Phe, Ser116->Ala この変異を入れ、Sensitiveなレシーバーを作る