Chiba/Quorum Sensing

From 2007.igem.org

(Difference between revisions)
(Size Control: Our Aim)
(Design)
Line 20: Line 20:
===Design===
===Design===
[[Image:Chiba_ahlsynth.png|frame]]
[[Image:Chiba_ahlsynth.png|frame]]
-
AHLはFig.2のpathwayで合成されている.AHLを増加させるために中間産物のs-adenosyl methionineの合成を増やしてみる.その為にmetK遺伝子を増やしてみる.
+
AHLはFig.2のpathwayで合成されている.AHLを増加させるためにMetKを過剰発現させ,methionineを加えてみる。
<br clear="all">
<br clear="all">

Revision as of 13:31, 26 October 2007

Chiba logo.png

Introduction | Project Design ( 1.Sticky Hands | 2.Communication | 3.Size Control ) | Making Marimos | Our Goal || Team Members | メンバ連絡簿


Size Control: Our Aim

Fig1.AHL concentration gradient.

(マリモのサイズをコントロールしたい/しなくてはならない:どっち?)マリモのサイズをコントロールする為にはAHLの届く範囲をコントロールできればよい.

  • AHLの届く範囲をコントロールするために以下の3つの方法を考えた:
    1. SenderのAHL生産能力をあげる
    2. ReceiverのAHL感受性をあげる
    3. AHL分解酵素aiiAを使う


1.Improving Sender

Design

Chiba ahlsynth.png

AHLはFig.2のpathwayで合成されている.AHLを増加させるためにMetKを過剰発現させ,methionineを加えてみる。

Experiment

Chiba AHL test 02.jpg

Result

AHL test photo 01.jpg AHL test photo 02.jpg

Discussion

  • 合成されたS-adenosyl Methionineがほかの代謝経路に使われて、AHL合成に使われなかったのだろうか.


2.Improving Receiver

Design

File:Mut LuxRの感度アップグラフ mutated LuxRによって感度が上がったという論文があった[ref].論文によれば1点にmutantをいれた場合wildtypeにくらべ10nMでのGPF発現量が増加する.3点にmutantをいれた場合wildtypeのGFP発現の限界が10nMに対して、1.5nMでGFPを発現することができるようになる。 私たちは3つのMutationをそれぞれ一つずつ入れたときは、3つのうち2つがGFPの発現量が多くなっているという理由から,そのうちの1点mutantと2点mutantを作った.

Experiment

File:作ったmut luxr 図のように1点&2点にミュータントをいれたluxrをsite direct mutagenesisで作成した. これをBBa_t9002プラスミドにいれた. AHLの入ったプレートにより感度を見た.また、蛍光リーダを用いて、10nMでの発現測定した。

Result

  • Ile45->Phe,Ser116->Alaの2か所の変異を入れたものは常にGFPを発現し続けるために、Swichingができなくなってしまった。AHLを入れずにGFPを発現。

Two mutation.jpg

  • 一か所変異を入れたものはwild typeのLuxRを発現するものよりもGFPの発現が多くなった。


3.Aiia

(なんかいいタイトルないかな)

Design1

Plux aiiA.jpg
図のように,AHLのシグナルが入るとaiiaを合成するような回路を考えた.Marimo全体がAHL quencherとして働く.Marimoの内側でAHLを分解し、Marimoの外側のAHL濃度を抑える.

Experiment

Result

  • BBa_T9002との比較ではGFPははじめ発現しないが、しばらくするとGFPが発現するようになる。

Discussion

  • 発現し始めた時が、AHLの濃度がaiiAの分解る能力を超えた時だと考えられる。

Design2

Rec inv aiia.jpg
図のようにインバーターをかませた.高い濃度ではaiiAが発現しないためAHLは分解されない.AHLが低い濃度ではaiiAが発現しAHLを分解する.よってマリモの中心付近ではAHLを分解せず,外側へ行くと分解される.

Experiment

このパーツを作ろうとしたが、inverterを組み合わせた時点で終わってしまった。